摘要：目的构建针对人转化生长因子（TGF）-β1基因的短发卡rna（shrna）表达载体并检测其对缺氧再给氧（A／R）损伤后的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）株的TGF-β1基因表达的影响。方法设计、合成并构建针对TGF-β1mrna的shrna表达载体，选择效果好者转染HUVEC株，再进行A／R试验，用免疫组织化学和逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测TGF-β1蛋白质和mrna的表达。结果优选出的表达载体pT12抑制率达（46．4±3．7）％。接受了A／R的T、H、L及C组，TGF-B1蛋白的A值分别为0．252±0．032、0．385±0．037、0．406±0．057及0．419±0．041，高于N组（0．103±0．008，P〈0．01），转染了pT12的T组4值又显著低于H、L和C组（P〈0．01）。A／R试验后T、H、L及C组的TGF-β1mrna转录量也多于N组（P〈0．05），T组的TGF-β1mrna转录量低于作为对照组的H组、L及C组（P〈0．05）。结论TGF—p1基因特异性shrna表达载体能有效地抑制A／R损伤导致的HUVEC株TGF-β1基因过度表达。

摘要：目的筛选出能高效抑制骨肉瘤细胞株MG63中人EAG1（hEAG1）基因表达的短发卡rna（shrna）。方法根据人EAG1信使rna（mrna）的序列，设计合成4对不同的且能干扰hEAG1基因表达的shrna。利用同源重组技术构建pGeneSil—hEAG1干扰载体，经酶切及测序鉴定后体外转染MG63细胞。采用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和蛋白印迹法（Westernblot）分别检测hEAG1mrna和蛋白的表达。结果成功合成4对shrna。细胞转染结果显示48h后实验组和对照组均有强荧光表达，转染率为70％。pGeneSil—hEAG1—2组的干扰效果最为明显，hEAG1mrna和蛋白表达较对照组明显下调，与其他组之间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论成功筛选出的shrna可高效阻断hEAG!的表达，可能成为骨肉瘤靶向性治疗的新策略。

摘要：目的 构建人泛素连接酶Cbl-b基因短发卡rna（shrna）重组慢病毒载体，探讨其对人黑素瘤A375细胞生物学行为的影响。方法 设计并合成3条沉默Cbl-b 基因的特异性shrna及1条阴性对照shrna，构建慢病毒载体。将A375细胞分成5组，即分别用3条特异性shrna转染的CBLB-shrna-1组、CBLB-shrna-2组、CBLB-shrna-3组，阴性对照组（阴性对照shrna转染），空白对照组（转染空载体）。应用实时荧光定量PCR和Western印迹检测转染后72 h各组A375细胞沉默效率；CCK8法检测转染后24、48、72及96 h细胞增殖能力；流式细胞仪检测转染后72 h细胞凋亡情况、细胞周期，Transwell法检测转染后72 h细胞侵袭能力。结果 成功构建3条Cbl-b shrna慢病毒载体，Western印迹示CBLB-shrna-3蛋白沉默效率最高。CCK8检测表明，CBLB-shrna-3组A375细胞增殖能力在转染后72 h和96 h较阴性对照组、空白对照组明显降低（均P 〈 0.01）。流式细胞仪检测示，CBLB-shrna-3组凋亡率［（22.73 ± 6.58）%］明显高于阴性对照组［（6.08 ± 1.35）%］和空白对照组［（6.34 ± 1.07）%，均P 〈 0.01］。CBLB-shrna-3组G1期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组（P 〈 0.01），而S期细胞比例明显低于阴性对照组和空白对照组（P 〈 0.01）。Transwell检测示，阴性对照组、空白对照组和CBLB-shrna-3组转染后72 h时穿膜细胞数分别为76.60 ± 1.82、73.20 ± 3.83、19.60 ± 1.14，差异有统计学意义（F = 794.50，P 〈 0.01）。结论 成功构建能高效沉默Cbl-b蛋白的CBLB-shrna-3重组shrna慢病毒载体，其可促进A375细胞凋亡，抑制A375细胞增殖、细胞周期进程和侵袭能力。

摘要：目的构建特异性针对人IQ结构域的GTP酶激活蛋白1(IQ-domain GTPase-activating protein 1,IQGAP1)基因短发卡rna(short hairpin rna,shrna)的重组质粒,检测其在人食管癌KYSE150细胞中的表达。方法以人IQGAP1 mrna序列为靶向设计合成含有shrna序列的寡核苷酸,克隆至真核表达载体GV102中,构建重组质粒IQGAP1-shrna,转化DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆测序鉴定。用脂质体2000介导IQGAP1-shrna转染KYSE150细胞作为IQGAP1-shrna干扰组,同时设转染载体GV102为对照组,RT-PCR及Western blot法检测IQGAP1基因的干扰效果。结果经测序鉴定,重组质粒IQGAP1-shrna构建正确。IQGAP1-shrna干扰组及对照组转染KYSE150细胞均可见绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),两组转染效率分别为(76±5. 780)%和(83±3. 851)%。IQGAP1-shrna干扰组IQGAP1 mrna转录水平和蛋白表达水平与对照组比较差异均有统计学意义(P <0. 001),表达抑制率分别为(82±2. 424)%及(77±2. 791)%。结论成功构建了IQGAP1-shrna真核表达质粒,能特异性降低食管癌KYSE150细胞中IQGAP1基因的表达,为进一步研究IQGAP1基因在食管癌中的功能及靶向治疗作用奠定了基础。

摘要：目的构建针对人类Polo-like kinase1（Plk1）基因的短发卡rna（shrna）真核表达载体，并进行腺病毒包被。方法设计并合成含有小发夹结构的Plk1 shrna对应模板序列，退火并与pYr-1．1载体重组质粒；通过LR体外同源重组将pYr-1．1-Plk1—shrna表达框构建至pAd—DEST腺病毒表达载体上；包装重组腺病毒；感染人类胰腺癌细胞BxPC-3验证干扰效率。实验分3组：对照组（Control）、空载组[rAd-增强绿色荧光蛋白（tAd—EGFP）]、实验组（rAd—shPlk1），实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）和Western blot检测Plk1基因的表达，流式细胞术检测细胞周期的变化及对细胞凋亡的影响。结果腺病毒感染BxPC-3细胞后，RT-qPCR检测Plk1 mrna表达量：对照组1．047±0．315、空载组1．121±0．199、实验组0．119±0．050；Western blot检测Plk1蛋白表达量：对照组0．760±0．088、空载组0．743±0．101、实验组0．050±0．043，实验组较对照组及空载组Plk1 mrna和蛋白水平均明显降低（P〈0．01）。流式细胞术检测G2期细胞比例：对照组6．077±0．056、空载组6．533±1．644、实验组33．427±7．774，实验组G：期细胞数比例显著高于空载组和对照组（P〈0．01）。感染24h后实验组的细胞凋亡率明显高于空载组和对照组（P〈0．01）。结论成功构建包被有Plk1 shrna的腺病毒表达载体，且重组腺病毒载体可以抑制Plk1基因的表达，引起细胞周期G2／M期停滞和促进细胞凋亡。

摘要：目的构建针对人Survivin基因的特异性短发卡rna(shrna)真核表达载体,并观察其在人脑胶质母细胞瘤U251细胞中对Survivin基因表达的抑制作用。方法根据SurvivincDNA编码序列,设计并合成针对Survivin基因的特异性rna干涉片断,将其克隆入pWH1质粒载体,构建Survivin基因shrna真核表达载体pWH1SR。通过脂质体介导将pWH1SR载体和空载体pWH1分别转染入U251细胞,经G418筛选,建立稳定转染的细胞系U251SR和U251P。采用RTPCR、Westernblot和免疫组化方法检测Survivinmrna和蛋白在U251、U251P和U251SR细胞中的表达水平。结果成功构建了Survivin基因shrna真核表达载体pWH1SR,经酶切鉴定证实克隆正确。获得了稳定转染pWH1SR载体和空载体pWH1的细胞系U251SR和U251P。U251SR细胞Survivinmrna和蛋白表达均受到明显抑制,抑制率分别达87%和91%;U251P细胞Survivin基因表达水平无明显变化。结论特异性shrna能够明显抑制Survivin基因在U251细胞中的表达,这为进一步研究Survivin在U251细胞中的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。

摘要：我们设计针对低氧诱导因子（HIF）-1α，hTERT的shrna表达质粒，转染人胶质瘤细胞U251，探讨rna干扰治疗胶质瘤的可行性。

摘要：目的筛选出干扰小鼠转酮醇酶(TK)的短发卡rna(shrna)表达载体。方法针对TK基因序列设计4条TK干扰序列:hMGFP-shrna1、hMGFP-shrna2、hMGFP-shrna3、hMGFP-shrna4,PstⅠ酶切鉴定其序列。然后利用质粒转染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6,用逆转录-聚合酶链式反应和酶活性方法检测转染TKshrna后Hepa1-6细胞内TK mrna和蛋白表达变化。结果经酶切凝胶电泳证实shrna载体构建正确,质粒筛选实验表明hMGFP-shrna1质粒对TK基因的抑制作用最强。结论成功构建表达靶向TK的shrna重组质粒载体。

摘要：目的 构建干扰Ppif基因的重组U6慢病毒质粒,观察内源性小干扰rna（sirna）的效果.方法 根据sirna设计原则,设计合成短发卡rna（shrna）,用于体内转录合成干扰Ppif编码序列的发夹rna.连接、筛选、酶切,鉴定Pgcl-GFP/U6 Ppif shrna;以含无关序列发夹结构的质粒载体为对照,感染大鼠肾细胞株,采用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）和Western blot检测mrna和蛋白表达水平与对照组的差异.结果 测序证实重组质粒构建成功,体外试验表明,Ppif基因的mrna和蛋白表达均一致降低[（0.582 ±0.014）％],与阴性对照组[（0.946±0.018）％]和空白对照组[（0.893±0.021）％]比较,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 慢病毒介导的Ppif-shrna成功在体外敲减了大鼠肾细胞的目的蛋白表达,影响了肾缺血再灌注的发生与发展.

摘要：目的构建表达靶向抑制survivin基因的表达短发夹结构(shrna)的rna干扰载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导以及细胞周期阻滞作用.方法在survivin全长序列中选取设计3条含19个核苷酸(19nt)靶序列两条反向重复序列,中间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点,分步酶切连接,构建出含有3条shrna模板且能独立编码shrna的重组干扰载体pGenesil-1/survivin;采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251;采用荧光定量PCR以及Westernbloting分别从mrna和蛋白水平检测干扰效果;采用Annexin-V/PI双色标记的流式细胞仪法检测sirna诱导的细胞凋亡,PI染色检测细胞周期阻滞.结果实时荧光定量PCR以及Westernblotting检测显示,survivin基因的mrna转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制;流式细胞仪检测分析显示,survivin基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高,细胞周期出现明显的G2/M阻滞.结论靶向survivin基因的重组sirna干扰载体pGenesi-l/survivin介导的rnai显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达,并明显地诱导了U251细胞发生凋亡和G2/M期细胞周期阻滞.