摘要：最近研究发现，白血病细胞凋亡受阻与生存素（survivin）的过度表达有关。为此，我们设计了survivin特异性短发夹状rna（short hairpin rna，shrna）真核表达载体，利用脂质体转染急性粒细胞白血病细胞株HL-60细胞，检测转染前后细胞survivin基因mrna和蛋白表达以及凋亡情况，探讨以survivin为靶点，将rna干扰（rna interference，rnai）用于白血病基因治疗的可行性。

摘要：多药耐药性的产生是导致肿瘤化疗失败的重要原因。多药耐药基因MDR1及其所编码的细胞膜P糖蛋白（P-gp）表达增加介导的耐药在化疗中最为主要、最为常见。在过去20多年中，学者们探求各种逆转多药耐药的方法，如反义寡核苷酸技术、核酶技术等，取得了一定的成果。rna干扰（rnai）技术抑制MDR1基因表达是研究逆转多药耐药的新途径。本研究设计并构建针对人MDR1基因特定位置的短发夹状rna（shrna）质粒pEGFP-H1／MDR1，观察其对卵巢上皮性癌（卵巢癌）紫杉醇耐药细胞株MDR1基因和P-gP表达的抑制作用，探索耐药肿瘤基因治疗的有效方法。

摘要：目的构建葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)基因的短发夹状rna(shrna),观察其对人耐药乳腺癌细胞GCS表达的抑制及多药耐药的逆转作用。方法设计2对GCS基因编码的反向重复序列,中间间隔6个nt,体外合成并克隆至载体pSUPER。转染乳腺癌细胞,Westernblot和免疫细胞化学方法测定GCS表达。Westernblot、比色法检测细胞内caspase-3的表达,流式细胞仪分析细胞凋亡率。四氮唑盐(MTT)法检测半数细胞抑制浓度。结果酶切和DNA测序证实重组质粒构建成功。转染后GCS蛋白含量分别下降80%和82%,GCS表达阳性率降低为18·1%和16·7%。caspase-3表达和活性均显著增强,细胞凋亡率明显增加,细胞对化疗药物耐药性有明显下降。结论shrna可有效抑制人耐药乳腺癌细胞中GCS表达,并可提高其对多种化疗药物的敏感性。

摘要：目的:构建产生缺氧诱导因子1α(HIF-1α)特异性短发夹状rna(shrna)的载体并检测其抑制作用,探讨该技术在前列腺癌治疗中的应用前景。方法:设计、合成针对HIF-1α的特异性shrna模板序列,将其插入含有U6启动子的psilencerTM2.1-U6载体中,得到shrna表达载体psilencer-HIF,在脂质体介导下转染前列腺癌细胞株PC-3M,应用绿色荧光蛋白质粒pEGFP共转染评价转染效率,RT-PCR及Western印迹检测其对HIF-1α表达的影响。结果:重组质粒psilencer-HIF经测序分析证实与设计的完全一致,共转染24 h后质粒转染效率为(89.26±4.72)%,其产生的shrna在PC-3M细胞中能诱导rna干扰(rnai),转染后48 h HIF-1αmrna和蛋白水平分别下降82.09%和81.61%(P0.05)。结论:成功构建了HIF-1α基因shrna表达质粒,其可有效抑制前列腺癌细胞中的HIF-1α的表达,为前列腺癌的基因治疗提供了新思路。

摘要：目的:设计构建负载双片段survivin短发夹状rna(shrna)的质粒载体,为进行前列腺癌(PCa)基因治疗的研究奠定基础。方法:分别设计2条靶向survivin基因的shrna,克隆至质粒载体中,再分别提取质粒酶切后回收、连接,构建重组质粒,提取重组质粒酶切鉴定、测序分析。结果:负载不同单片段survivinshrna的质粒载体分别用EcoRⅠ及SacⅠ酶切鉴定,证实设计的2条单片段survivinshrna已经分别插入目的质粒中;基因重组后,重组质粒载体用BamHⅠ酶切鉴定,证实双片段survivinshrna均已插入重组质粒载体中;测序结果证实重组质粒载体插入的双片段survivinshrna序列均正确无误。结论:负载双片段survivinshrna的rna干扰重组质粒载体构建成功。

摘要：目的为探讨rna干扰对HL-60细胞的抑制作用,构建survivin的短发夹状rna真核表达载体并将其导入白血病细胞株HL-60细胞。方法设计、合成两对针对survivin的短发夹状rna序列,连接到带有人U6启动子的载体质粒pSINsi-hU6中,将构建重组质粒命名为pSIN/shrna1和pSIN/shrna2。pSIN/shrna1转染HL-60细胞,应用四唑盐(MTT)比色法观察细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果酶切分析和测序证实pSIN/shrna1和pSIN/shrna2构建成功。MTT测定显示转染重组质粒pSIN/shrna1进入HL-60细胞48、72、96 h后细胞增殖明显受到抑制,分别与阴性对照组、空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪分析pSIN/shrna1细胞凋亡率达(20.21±0.75)%,明显高于阴性对照组的(2.58±0.48)%和空白对照组的(1.26±0.30)%(P<0.05)。结论构建survivin基因rnai真核表达载体成功;pSIN/shrna1序列可特异性地抑制HL-60细胞的增殖并诱导其凋亡。

摘要：rna干扰已成为当前肿瘤基因治疗的新策略，我们设计了针对血管内皮生长因子（VEGF）短发夹rna（shrna），观察其对人胃癌细胞血管VEGF表达的影响。

摘要：目的:构建survivin基因短发夹状rna(shrna)真核表达载体,并观察其对宫颈癌细胞survivin表达的抑制作用。方法:设计、合成2对survivin特异性微小片段rna引物(s1、s2),退火连接后利用DNA重组技术,将其分别克隆入真核表达载体pSilencer 2.1-U6 neo,酶切、鉴定测序后,经脂质体转染宫颈癌HeLa细胞,G418筛选阳性克隆,半定量RT-PCR检测survivin mrna表达,Western blot检测survivin蛋白表达。结果:成功构建了survivin shrna真核表达载体pSilencer2.1-s1和pSilencer2.1-s2,G418筛选24 d后出现阳性克隆,转染pSilencer2.1-s1和pSilencer2.1-s2的HeLa细胞中,survivin表达呈现不同程度下调,pSilencer2.1-s2的干涉效果较好。结论:成功构建并筛选出干涉效果较好的survivin shrna真核表达载体,为进一步研究其对宫颈癌细胞生物学行为的影响奠定了实验基础。

摘要：目的　构建在哺乳动物细胞中表达MDR1短发夹rna(shorthairpinrna ,shrna)的表达质粒 ,并初步探讨其对耐药肝癌细胞MDR1mrna的抑制作用及抗肿瘤药物耐药性的影响。方法　根据Genbank中MDR1mrna设计的两条多聚核苷酸序列 ,退火形成双链DNA ,再与经双酶切后的载体PGE 1连接 ,构建 pshrna MDR1重组质粒 ,在脂质体的介导下转染肝癌细胞株BEL 74 0 2 /ADM ,RT PCR分析MDR1mrna的表达 ,MTT法检测阿霉素对细胞的半数抑制浓度 (IC50 )。结果　PCR和DNA测序证实了表达质粒构建成功 ,并能明显地抑制BEL 74 0 2 /ADMMDR1mrna的表达 ,对阿霉素的耐药指数降低了17.5倍 ( 2 99.2 / 17.1)。结论　构建的 pshrna MDR1表达质粒能有效地抑制转染细胞MDR1mrna ,从而提高肿瘤细胞的药物敏感性。

摘要：目的:构建含荧光素酶(luciferase,luc)基因的短发夹状rna(short hairpin rna,shrna)表达质粒,并观察其在肝癌细胞Bel-7402中抑制外源荧光素酶的表达. 方法:设计的两条反向重复的多聚核苷酸序列,退火形成双链DNA,再与双酶切后的载体PGE-1连接,构建pshrna-luc重组质粒,与荧光素酶基因表达质粒pCMV- luc共转染肝癌细胞株BEL-7402,检测其对荧光素酶表达的影响. 结果:PCR和DNA序列分析证实了重组质粒构建成功. pshrna-luc对共转染的pCMV-luc中的荧光素酶具有明显的抑制作用,抑制率可达86%(P<0.01). 结论:构建的pshrna-luc表达质粒能有效地抑制荧光素酶在肝癌细胞中的表达,为rna干扰用于肿瘤的基因治疗打下基础.