摘要：为建立检测禽多瘤病毒(avian polyomavirus,APV)的快速诊断方法,根据APV VP4基因的保守序列设计并合成引物和探针,建立了TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,验证了其特异性、敏感性和重复性,并利用建立的方法对采集的临床样本组织进行检测。结果显示,建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的C_(t)值与标准品在1.0×10^(9)~1.0×10^(2)copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.996,斜率为-3.021,检测下限为1.0×10^(1)copies/μL,与其他禽源病毒未发生交叉反应,重复性试验的变异系数均小于2%,重复性好,并且该方法在实际临床检测中可行。上述结果表明,建立的方法可用于禽多瘤病的早期诊断和APV快速检测。

摘要：为了解鹦鹉禽多瘤病毒(APV)陕西分离株(SX-2018株)VP1基因的分子特征,并建立可用于临床的快速灵敏的APV检测方法,本研究通过PCR扩增了SX-2018株VP1基因序列,并与22株国内外参考株进行了核苷酸同源性比较和遗传进化分析。结果显示:扩增的SX-2018株VP1基因全长为1032 bp,与其他APV分离株核苷酸相似度为99.1%~100.0%;遗传进化分析显示SX-2018株属于CladeⅡ分支。设计针对VP1基因的特异性引物(209 bp)并构建其相应的质粒标准品,以不同浓度的该质粒标准品为模板扩增并绘制了标准曲线,通过条件优化建立了APV SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示:建立的荧光定量PCR方法仅特异性扩增APV,与鹦鹉其它常见病毒无交叉反应,特异性强;对质粒标准品检测的最低浓度达5.4×101拷贝/μL,为常规PCR的100倍;组内组间变异系数分别小于0.5%、1.5%,重复性好。利用该方法与常规PCR方法对疑似APV感染的30份样品进行检测并比较,结果显示:建立的APV SYBR Green荧光定量PCR检测方法与常规PCR的符合率为86.67%,且阳性检出率高于常规PCR。本研究为我国鹦鹉APV的分子流行病学调查提供了参考数据,为在鹦鹉群中开展该病的筛查提供了有效的技术手段。

摘要：鹦鹉幼雏病是由禽类多瘤病毒(APV)引起的多种鹦鹉雏鸟死亡的急性病毒性传染病,严重危害鹦鹉养殖业的健康发展。为提高分子生物学方法检测APV的敏感性和特异性,对APV基因片段进行克隆和序列分析,设计合成1对特异性引物,以VP1基因为模板,经PCR扩增获得731 bp的核苷酸DNA,并用DIG标记,制备用于检测APV的特异性核酸探针;对制备的探针进行灵敏度检测,同时与普通PCR进行敏感性比较;使用制备的探针,对经分离鉴定和制备保存的其他7种禽病毒核酸进行特异性检测;用该核酸探针,对疑似感染APV的鹦鹉病料进行斑点杂交检测,并对鉴定为阳性的APV进行全基因组扩增和序列分析。结果显示:该探针可检测到2 pg量的APV特异性核酸片段;仅APV-VP1阳性核酸显色,呈现阳性反应,而阴性核酸和其他7种禽病毒核酸均不显色,呈阴性反应。结果表明:建立的核酸斑点杂交检测方法具有较高的灵敏度和特异性,可用于临床初步诊断。本方法的建立为我国开展APV分子流行病学调查及其感染的临床诊断提供了技术支撑。