摘要：旨在构建人AAVS1位点定点敲入的诱导表达型ERK-SPARK激酶荧光探针的人食管鳞癌细胞株(KYSE-150)。根据AAVS1位点的DNA序列设计和已公开ERK-SPAEK荧光探针碱基序列构建了两端带有750 bp同源臂的诱导型ERK-SPARK表达盒的同源重组供体质粒。其次,利用在线设计工具设计了3个靶向AAVS1位点的sgRNA,并克隆至pX330骨架质粒中得到3个能定点切割AAVS1位点的CRISPR/Cas9打靶载体,将同源重组供体质粒分别与表达CRISPR/Cas9打靶载体共转染KYSE-150细胞,经Dox诱导表达24 h后进行嘌呤霉素抗性筛选和流式细胞分选,得到抵抗嘌呤霉素且表达GFP的细胞亚群。再应用PCR鉴定基因型,以及Western blot检测蛋白表达。对获得的细胞群提取基因组DNA并进行PCR基因型鉴定,结果显示获得片段的大小与诱导型ERK-SPARK表达盒的大小一致。蛋白表达检测结果显示,该细胞群表达了ERK-SPARK探针融合蛋白。荧光探针成像实验结果显示,在未经Dox诱导表达条件下,细胞株有极少量泄漏表达;经Dox诱导表达后,GFP荧光蛋白在细胞质内均匀分布,无明显聚集成点现象;在加入EGF激活ERK激酶后,原本在细胞质内均匀分布的GFP绿色荧光聚集成高亮度的绿色液珠。成功获得了可诱导表达检测ERK激酶活性的SPARK荧光探针的稳定细胞株,解决了瞬时表达ERK-SPARK探针效率不稳定影响实验结果准确性的问题,为后续建立基于SPARK技术的高通量蛋白激酶抑制剂的筛选平台奠定了前期研究基础。

摘要：为更好地研究靶向硫氧还蛋白还原酶1的小分子化合物的细胞内靶点选择性,利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除TrxR1基因(编码硫氧还蛋白还原酶1)的HCT-116细胞株。首先根据TrxR1基因序列和CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计并选择合适的敲除位点,再根据敲除位点序列设计敲除TrxR1基因的sgRNA干扰序列,以pCasCMV-Puro-U6空质粒载体为骨架构建能表达该sgRNA干扰序列的重组质粒。质粒共转染至HCT-116细胞后,利用嘌呤霉素筛选TrxR1敲除的HCT-116细胞,通过DNA测序、免疫蛋白印迹、TRFS-green荧光探针和细胞内TrxR1酶活力检测等方法鉴定和验证HCT-116细胞的TrxR1基因敲除效果。进一步通过CCK-8实验初步研究靶向TrxR1小分子化合物对细胞内TrxR1酶活力和细胞增殖力抑制的相关性。结果显示,表达sgRNA干扰序列的重组质粒可以敲除HCT-116细胞中TrxR1基因,筛选获得的稳定敲除细胞HCT116-TrxR1-KO中无TrxR1蛋白表达,而靶向TrxR1小分子抑制剂对该细胞无TrxR1酶活力和细胞增殖力抑制效果。本研究利用CRISPR/Cas9系统成功构建了HCT-116的TrxR1基因敲除的稳定细胞株,为进一步研究TrxR1在相关疾病的发生机制和治疗中的作用奠定了基础。

摘要：目的构建携带绿色荧光蛋白(GFP)的人Fox M1 sh RNA重组慢病毒载体,并构建筛选Fox M1敲低的人前列腺癌稳定细胞株,检测Fox M1的表达及对细胞增殖能力的影响。方法设计并合成3对特异性针对人Fox M1基因的sh RNA靶序列,构建到p HBLV-U6-Zs Green-Puro慢病毒载体中,测序鉴定载体构建情况,利用慢病毒三质粒系统转染包装293T细胞,荧光显微镜下观察转染效率。收集到的病毒上清转染人前列腺癌DU-145细胞,Real-time PCR检测各组细胞Fox M1 m RNA水平,经嘌呤霉素筛选建立Fox M1敲低稳定细胞株,用Western blotting法检测细胞中Fox M1表达,并用MTT法观察稳转细胞的生长增殖活性,流式细胞术观察稳转细胞凋亡情况,平板克隆实验观察稳转细胞的克隆形成能力。结果经测序鉴定成功构建了3对Fox M1sh RNA慢病毒载体,并进行包装,感染DU-145细胞后Real-time PCR检测结果表明第1对慢病毒载体干扰效率最佳,嘌呤霉素抗性筛选建立了Fox M1敲低稳定细胞株,荧光显微镜观察感染效率较高,Western blotting结果显示细胞中Fox M1蛋白表达明显受到抑制,细胞的生长增殖能力明显受限,流式细胞术结果显示Fox M1敲低组细胞凋亡率高于对照组,平板克隆实验结果表明Fox M1敲低组细胞克隆形成能力下降。结论本研究成功构建了Fox M1 sh RNA慢病毒载体,建立了Fox M1敲低稳定前列腺癌细胞株,抑制细胞内Fox M1的表达能够抑制前列腺癌细胞DU-145的生长增殖、克隆形成能力,并能诱导细胞凋亡。

摘要：目的构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的第10染色体丢失的磷酸酶基因(phasphatase and tensin homo-log deleted in chromosome 10,PTEN)的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,并在转染人子宫腺肌病(adenomyosis,AM)细胞后筛选最优稳转株。方法设计合成3条特异性针对人PTEN基因的shRNA序列,构建到pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO载体中,测序鉴定载体构建情况,进而包装病毒并检测滴度。筛选出最优感染复数(multiplicity of infection,MOI)、嘌呤霉素杀灭浓度后,用慢病毒液转染AM细胞,以嘌呤霉素药筛建立PTEN敲低的稳定细胞株,采用实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测转染后细胞内PTEN mRNA表达水平,蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测PTEN蛋白表达水平,以检验转染效率并筛选出干扰效率最佳的shRNA序列。结果成功构建了3个PTEN shRNA慢病毒载体,包装后以MOI为50转染AM细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达明显,嘌呤霉素持续药筛建立了PTEN敲低的稳定细胞株,以PTEN shRNA3慢病毒载体的干扰效率最佳(92.98%)。结论成功构建了PTEN shRNA慢病毒载体,并在体外有效转染了AM细胞,建立了PTEN敲低的稳定细胞株。

摘要：构建并鉴定人CARABIN蛋白过表达慢病毒载体,筛选CARABIN过表达的弥散性大B淋巴瘤细胞SUDHL-6的稳定细胞株。通过设计Carabin上下游引物,用同源重组的方法构建慢病毒载体pLENTI-c GFP-CARABIN,将其与psPAX2和pMD2.G包装质粒按3∶2∶1的比例用PEI Transfection Reagent共转染HEK293T细胞制备病毒,用病毒颗粒感染SU-DHL-6细胞2周后,用流式细胞仪分选GFP表达阳性的细胞,Western Blot检测CARABIN-GFP融合蛋白表达。成功构建pLENTI-c GFP-CARABIN慢病毒过表达载体。包装病毒颗粒并感染SU-DHL-6细胞后,荧光显微镜检测和流式细胞分选鉴定表达效率为26.5%,筛选出的GFP阳性细胞用Western Blot检测到CARABINGFP融合蛋白表达。成功构建了Carabin过表达慢病毒载体并筛选出了CARABIN-GFP稳定表达的细胞株。

摘要：目的建立起能够稳定表达NLRC5基因的肝癌Hep G2细胞株。方法设计遗传霉素(G418)的浓度梯度,通过对Hep G2细胞筛选最终确定筛选药物浓度。将构建好的人源p EGFP-C2-NLRC5重组质粒利用脂质体介导法转染至Hep G2肝癌细胞株中,用G418筛选出耐药阳性克隆。通过免疫荧光技术观察绿色荧光蛋白稳定表达情况,Western blot法验证NLRC5蛋白表达情况。结果 G418在14 d内使Hep G2细胞全部死亡的最小浓度是300 ng/ml。用G418筛选瞬转p EGFP-C2-NLRC5 14 d在荧光显微镜下可见耐药克隆的形成。Western blot法检测显示,稳定过表达组NLRC5的蛋白水平比空质粒转染组高(t=15.356,P<0.05)。结论成功构建稳定表达NLRC5基因的肝癌细胞株,为进一步研究NLRC5基因在肝癌的体内实验奠定了基础。

摘要：基于CRISPR/Cas9n double nick技术构建人DNAH2(Homo sapiens dynein,axonemal,heavy chain 2)基因敲除的U2OS稳定细胞株,旨在研究DNAH2基因的生物学功能。首先设计并合成A、B两个sg RNA(Single guide RNA)以及各自的互补链,退火连接形成DNAH2 sg RNA-A、B双链,再分别与带有BbsⅠ粘性末端的p X462线性载体相连,形成p X462-DNAH2-A、p X462-DNAH2-B重组真核表达质粒。质粒共转染至U2OS细胞后,加入嘌呤霉素,以有限稀释法获得阳性单克隆细胞株,再以蛋白印迹实验检测DNAH2蛋白的表达,最后通过PCR-基因测序技术分析突变特点。结果显示A、B sg RNA双链成功插入p X462载体,U2OS-DNAH2-KO单克隆细胞株中DNAH2蛋白不表达,DNAH2基因发生移码突变,从而证实利用CRISPR/Cas9n double nick系统成功构建人DNAH2基因敲除的U2OS稳定细胞株,为研究DNAH2基因提供有利工具。

摘要：【目的】基于CRISPR/Cpf1(AsCpf1/LbCpf1)技术构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的人胚肾细胞(HEK293T)稳定细胞株,旨在研究ABCG1和ABCG4基因的生物学功能。【方法】针对ABCG1和ABCG4基因作用的功能域,设计2对靶向ABCG1和ABCG4基因前7个外显子的sgRNA序列,分别克隆到AsCpf1和LbCpf1的载体上。将测序验证正确的重组质粒转染到HEK293T细胞中,T7E1酶切和测序验证敲除效率,对敲除成功的293T细胞利用有限稀释法筛选获得基因双突变的敲除细胞株,对其基因组进行PCR扩增并双向测序验证编辑结果,选择有正确编辑结果的PCR产物进行TA克隆,进而测序验证单克隆细胞株编辑效率。【结果】结果获得敲除ABCG1和ABCG4基因的稳定细胞株各1株(AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1-1和LbCpf1-ABCG4-sgRNA 2-1)。【结论】通过利用新型基因编辑技术CRISPR/Cpf1系统,获得了永久性敲除目的细胞靶基因的细胞株,可为进一步探索和证实ABCG1和ABCG4在细胞中胆固醇代谢和调节作用提供帮助。

摘要：[目的]体外制备阻断剂单克隆抗体,并对表达工艺进行优化。[方法]通过RLM-RACE技术钓取杂交瘤细胞抗体基因序列,经分子克隆构建至真核表达载体pCHO1.0,在CHO-S细胞中构建稳定表达细胞株;运用DOE实验设计方法,筛选最佳培养基、培养温度及补料方式;在5 L生物反应器进行工艺验证,蛋白A亲和纯化后用化学发光法进行阻断性能验证。[结果]目的基因序列钓取成功,稳定表达单克隆细胞株11H7表达量为2.90 g/L;使用CHO Max A培养基、梯度补料策略、32℃培养可将表达量提升至5.28 g/L,5 L生物反应器表达量为5.47 g/L,纯度均>95%,且在磁微粒G17和ProGRP项目异常样本中检测满足阻断性能需求。[结论]阻断剂单克隆抗体构建成功,通过表达工艺优化,表达量由2.90 g/L提升至5.28 g/L,且在生物反应器中得到初步验证。

摘要：利用CRISPR/cas9系统建立稳定敲除PKA C-α基因的INS-1细胞株,研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能。设计2个长25 bp且分别靶向PKA C-α基因的exon 5和exon 7的sgRNA,将其克隆至LentiCRISPRv2-sgRNA质粒并转染至293T细胞中制备sgRNA-Cas9慢病毒,慢病毒感染INS-1细胞,嘌呤霉素筛选出阳性细胞并采用有限稀释法筛选单克隆细胞,Western blotting印记法检测单克隆细胞中PKA C-α蛋白的表达水平,测序确认单克隆细胞中PKA C-α基因的突变位点。WB实验证实靶向Exon 5的sgRNA可成功敲除PKA C-α基因,得到稳定敲除PKA C-α基因的细胞株,测序结果表明该细胞株的PKA C-α基因发生1 bp碱基插入突变,并且敲除PKA C-α基因的INS-1细胞胰岛素分泌能力下降。本实验利用CRISPR/Cas9系统成功敲除INS-1细胞中的PKA C-α基因,为研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能奠定了基础。