摘要：旨在建立能稳定表达猪GM-CSF的细胞系。本研究利用NCBI已公布猪GM-CSF基因序列设计引物,采用RT-PCR法扩增出猪GM-CSF开放阅读框(ORF)。发现其长435bp,编码144个核苷酸的蛋白。该蛋白分子质量为16.3ku,等电点为7.15。与绵羊、马、猫、牛、狗和人的同源性分别为77.1%、73.6%、72.2%、71.5%、71.3%和70.8%。通过EcoR I和BamH I酶切后,将GM-CSF基因插入pIRES2-EGFP载体中,构建出pIRES2-EGFP-pGM-CSF重组质粒。该重组质粒转染猪肠上皮细胞(IPEC-J2)后,G418筛选阳性细胞。在转染后24h,荧光定量PCR可见GM-CSF mRNA表达量较对照组及空载体组细胞显著升高(P<0.01),荧光显微镜下亦可见大量绿色荧光表达。该细胞系在含有G418的培养液中连续传代30次,仍可见GM-CSF基因和蛋白水平的高表达。本研究成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-pGM-CSF和能稳定表达猪GM-CSF的细胞系。

摘要：目的:构建GFP-Plk1同义突变表达载体及其稳定转染细胞系。方法:设计Polo样激酶1(Plk1)si RNA序列及相对应的同义突变引物,并利用二次PCR方法扩增Plk1基因,定向克隆到p Rex-EGFP-IRES-Hygro载体中,构建p Rex-EGFP-r Plk1-IRES-Hygro表达载体;利用逆转录病毒感染的方法,构建He La/GFP-r Plk1稳定细胞系;利用免疫印迹及激光共聚焦显微镜,验证Plk1 si RNA的干扰效果及稳定细胞系的构建。结果:双酶切鉴定和测序结果表明构建的p Rex-EGFP-r Plk1-IRES-Hygro正确;免疫印迹实验证明Plk1 si RNA序列可以有效抑制He La/GFP-r Plk1细胞中内源性Plk1蛋白的表达,但不能干扰掉外源GFP-r Plk1蛋白;在荧光共聚焦显微镜下,观察到有丝分裂的前中期和末期,GFP-r Plk1分别定位于着丝粒和中间体上。结论:构建了Plk1同义突变表达载体p Rex-EGFP-r Plk1-IRES-Hygro和He La/GFP-r Plk1稳定细胞系,为下一步研究Plk1在有丝分裂期的调控机制提供了模型。

摘要：试验旨在构建一株高效表达猪CD163(pCD163)的Marc-145细胞系,为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的临床分离和疫苗生产奠定基础。根据GenBank中序列设计引物从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增pCD163基因,将其插入真核表达载体pCI-neo构建真核表达质粒pCIpCD163,将该重组质粒转染Marc-145细胞,通过G418筛选、单克隆化并扩大培养筛选获得表达pCD163的Marc-145细胞系,IFA、Western blotting鉴定其表达情况。IFA结果显示,构建的pCD163-Marc细胞系中荧光明显亮于普通Marc-145细胞;Western blotting结果显示,pCD163-Marc细胞系中CD163蛋白表达量约为对照Marc-145细胞中CD163蛋白表达量的8.7倍。且该细胞系可稳定传至20代,各代次之间表达量无差异。证明高效表达猪CD163的Marc-145细胞系构建成功。

摘要：目的研究多梳蛋白家族成员NSPc1对HeLa细胞增殖的影响。方法运用生物信息学设计并合成敲低NSPc1表达的siRNA序列,用半定量RT-PCR、Real-time PCR及Western blot等检测siRNA序列在HeLa细胞中敲低NSPc1的有效性;将相应有效序列构建到pSUPER载体中,观察其瞬时转染对HeLa细胞BrdU掺入的影响;用G418筛选并建立稳定敲低NSPc1的HeLa细胞系,观察敲低NSPc1对HeLa细胞体外增殖能力的影响。结果(1)设计的siRNA序列可显著敲低NSPc1的表达;(2)瞬时敲低NSPc1阻碍了HeLa细胞BrdU的掺入;(3)成功构建稳定敲低NSPc1的HeLa细胞系,其增殖速度较对照组明显变慢。结论NSPc1的正常表达是维持HeLa细胞正常增殖能力所必需的,稳定敲低NSPc1的HeLa细胞群可作为进一步研究NSPc1相关信号通路的有效模型。