摘要：目的构建LL-37慢病毒过表达载体,稳定转染RAW264.7细胞株,并检测LL-37在胞内mRNA和蛋白表达情况。方法根据GenBank数据库获取抗菌肽LL-37的蛋白编码基因序列,同时选择合适的酶切位点并设计特异性的上、下游引物,PCR扩增目的基因。用SalI、Age I限制性内切酶对载体和目的基因进行双酶切,将酶切目的片段与载体进行重组。重组质粒冰水浴30 min、42℃热激1.5 min、冰上放置2 min后转化入DH5α感受态细胞。将感受态细胞在不含氨苄的LB培养基中,37℃、200 r/min培养1 h。将转化菌在含氨苄平板上进行筛选,阳性菌落进行PCR和测序鉴定,鉴定正确的菌落进行扩增并大量抽提质粒。将20μg GV载体质粒、15μg pHelper 1.0载体质粒、10μg pHelper 2.0载体质粒与转染试剂混合后共转染293T细胞,收集细胞上清液,经离心、过滤后保存。将包装浓缩后的慢病毒按照MOI=100稳转RAW264.7细胞株,并用嘌呤霉素筛选LL-37慢病毒过表达RAW264.7细胞株。分别采用RT-PCR和间接免疫荧光技术检测转染成功的RAW264.7细胞中mRNA和蛋白表达情况。结果成功获得7487 bp的线性化载体和164 bp的LL-37PCR片段,成功构建LL-37慢病毒过表达载体。将重组质粒转化到DH5α感受态细胞中,经PCR和测序鉴定重组质粒构建正确。经包装浓缩后的慢病毒成功稳转RAW264.7细胞株,并用嘌呤霉素筛选出LL-37慢病毒过表达RAW264.7细胞株。RT-PCR检测携带重组质粒的慢病毒转染的RAW264.7细胞,胞内mRNA有良好表达丰度,LL-37基因的表达丰度为9074.883(P<0.01)。加入LL-37抗体的细胞株组在CQ1荧光拍照下能够观察到荧光,空白组和阴性对照组无此荧光,表明稳转LL-37 RAW264.7细胞株构建成功。结论成功构建LL-37慢病毒过表达载体并获得在胞膜及包浆均有大量表达LL-37的慢病毒稳转RAW264.7细胞株,为LL-37相关作用机制研究奠定了基础。

摘要：旨在利用Piggy Bac转座子系统构建表达狂犬病病毒(rabies virus,RABV)糖蛋白(glycoprotein,G)的稳转细胞株,为复制缺陷型RABV的拯救与培养奠定基础。根据NCBI公布的RABV SRV9株G基因序列设计引物,利用PCR技术扩增RABV-G基因并将其克隆至真核表达载体YHM-spCas9,构建重组质粒YHM-SRV9-G。将重组质粒与Piggy Bac转座子酶辅助质粒共转染BSR细胞,利用20 mg/L灭瘟素S盐酸盐(blasticidin)连续筛选2周后获得有抗性的细胞簇。利用有限稀释法连续2次单克隆纯化后获得稳定表达RABV-G蛋白的单克隆细胞株BSR-G。PCR、间接免疫荧光及Western blot鉴定结果显示,BSR-G细胞携带RABV-G基因并可表达G蛋白,激光共聚焦结果显示RABV-G蛋白定位在细胞膜。将缺失G基因的重组狂犬病病毒(rSRV9-△G-eGFP)分别感染BSR和BSR-G细胞,发现rSRV9-△G-eGFP可在BSR-G细胞中增殖。本研究成功构建了稳定表达RABV-G蛋白的稳转细胞株BSR-G,为狂犬病复制缺陷型基因工程疫苗的研制奠定了基础。

摘要：该研究通过慢病毒感染的方式构建携带T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3及可结晶区域[T cell immunoglobulin and mucin domain 3 and fragment of crystallizable,TIM-3(Fc)]目的基因的稳定转染细胞株并检测TIM-3(Fc)分泌蛋白的表达。设计特异性引物PCR扩增TIM-3(Fc)片段,重组插入慢病毒表达载体pCD513中并鉴定阳性克隆,无内毒素提取质粒pCD513-TIM-3(Fc)、pSPAX2和pMD2.G共转染293T细胞包装慢病毒,再利用慢病毒感染悬浮HEK293细胞,最后通过嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株293/TIM-3。再通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测TIM-3(Fc)目的基因在转录和翻译水平上的表达,用时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)检测细胞产生TIM-3(Fc)分泌蛋白的能力。成功构建了pCD513-TIM-3(Fc)慢病毒表达载体,qRT-PCR、WB和TRFIA检测表明,293/TIM-3细胞株成功表达了TIM-3(Fc)分泌蛋白。成功构建了重组人可溶性TIM-3稳定转染细胞株293/TIM-3并成功表达了TIM-3(Fc)分泌蛋白,为进一步研究可溶性TIM-3蛋白的生物学功能提供基础。

摘要：背景:溶质载体家族1成员5(solute carrier family 1 member 5,SLC1A5)在多种疾病中发挥了潜在作用,但确切作用机制尚不清楚。构建稳定的SLC1A5过表达和敲低细胞模型可为深入研究SLC1A5在疾病中的确切作用机制以及发现潜在治疗靶点提供有力的实验工具。目的:构建小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体,以建立稳定转染的RAW264.7细胞株,为深入探讨SLC1A5在炎症中的作用提供实验基础。方法:根据SLC1A5基因序列设计合成引物并使用聚合酶链反应扩增该基因片段。将目的基因定向接入经Age I/Nhe I酶切的载体质粒GV492中构建重组慢病毒质粒,对阳性克隆进一步筛选后测序比对结果;pHelper1.0质粒载体、pHelper2.0质粒载体、目的质粒载体与293T细胞共同培养并转染,获得慢病毒原液进行包装和滴度测定;在此基础上,通过体外培养RAW264.7细胞,确定嘌呤霉素工作质量浓度;不同滴度的慢病毒分别与RAW264.7细胞共同培养,根据荧光强度确定转染效率;用嘌呤霉素挑选出稳定转染细胞,实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹方法检测稳定转染细胞株的SLC1A5基因和蛋白表达水平。结果与结论:(1)测序序列与目的序列一致提示重组慢病毒载体构建成功;(2)过表达SLC1A5慢病毒的滴度为1×10~9 TU/mL,敲低SLC1A5慢病毒的滴度为3×10~9 TU/mL;(3)确定RAW264.7细胞嘌呤霉素工作质量浓度为3μg/mL;(4)过表达/敲低SLC1A5慢病毒转染RAW264.7细胞的最佳条件皆为HiTransG P转染增强液且感染复数值等于50;(5)过表达SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量明显上调,而敲低SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量显著下调。结果表明,成功构建了小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体并获得稳定转染的RAW264.7细胞株。

摘要：目的 :构建过表达生长分化因子11(GDF11)的神经胶质瘤U251稳转细胞株。方法 :合成GDF11全长序列,构建HBLV-h-GDF11-3×flag-LUC-PURO慢病毒载体。将其与质粒pAX2和pMD2G共同转染293T细胞,收集上清并浓缩,获得慢病毒浓缩液。利用该慢病毒感染U251细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定过表达GDF11的细胞株,通过RT-PCR鉴定稳转细胞株中GDF11 mRNA的表达水平。结果 :测序结果与设计序列一致,慢病毒浓缩液滴度为3.0×10^(8) TU/mL,RT-PCR结果显示在该稳转细胞株中GDF11表达水平上调154倍。结论 :成功构建了稳定过表达GDF11的U251细胞株,为进一步研究GDF11在神经胶质瘤中的作用奠定了基础。

摘要：研究表明,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)与肿瘤的发生、发展、临床表型及治疗和预后有关.为阐明G6PD与肿瘤的关系及其机理,针对人G6PD基因设计3条siRNA和一条无关序列,再据每一序列,合成两条互补并含siRNA正反义链的DNA,退火后与含GFP的载体pRNAT-U6.2/Lenti连接,转染人皮肤黑色素瘤A375细胞,Real-timePCR筛选有效的一条siRNA,经病毒颗粒包装和病毒生产并感染A375细胞,G418筛选后,挑取单个阳性克隆放大培养,Western blotting检测siRNA干扰G6PD效率为88.83%,构建成G6PD缺陷型A375稳转细胞(A375-G6PD!).与野生型A375细胞(A375-WT)比较,A375-G6PD!的G6PD活性仅为21.53%,细胞倍增时间延长,增殖被抑制,克隆形成率降低25%(P0.05),提示,G6PD缺陷可能通过下调P53蛋白表达和上调Caspase-3的表达,抑制G2/M期向G0/G1期转换的进程,促进A375的凋亡,机理有待于进一步探讨.

摘要：背景与目的核因子-κB作为重要转录因子,与多种恶性肿瘤的发生发展有着密切联系,直接或间接抑制NF-κBp65的表达可逆转肿瘤细胞生物学行为。构建人核因子-κBp65基因shRNA重组质粒,感染A549细胞并筛选出稳定细胞株,对其迁移、粘附能力进行鉴定。方法设计并合成人核因子-κBp65的乱序对照序列(scramble)和干扰序列(shRNA)构建重组质粒,在5’端引入一个BamHI位点,3’端引入一个XhoI位点和EcoRI位点;感染A549细胞并由嘌呤霉素做稳转株的筛选;应用Western blot、qRT-PCR技术检测NF-κBp65的干扰效果及IκBα蛋白表达水平的变化;Transwell、MTT法分析其对A549细胞迁移、粘附能力的影响。结果成功构建重组质粒并筛选出A549/NF-κB p65scramble稳转株和A549/NF-κB p65 shRNA稳转株;A549/NF-κB p65 shRNA稳转细胞株与A549/NF-κB p65 scramble稳转细胞株及A549细胞相比NF-κBp65的mRNA、蛋白表达水平均下调;IκBα蛋白水平明显下调;细胞迁移能力及粘附能力均降低。结论本实验通过RNA干扰技术构建的重组慢病毒可有效抑制NF-κBp65 mRNA和蛋白的表达水平;抑制NF-κBp65可明显降低A549细胞的迁移和粘附能力。