摘要：背景细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)是一类具有细胞膜穿透能力的多肽,可以作为药物载体携带大分子物质进入细胞,其因低毒性和多组织普适性广泛运用于医学成像和治疗的研究中。目的构建穿膜肽钴原卟啉药物复合体(R6-CoPP),研究其生物相容性和减轻晶状体上皮细胞氧化应激损伤的作用。方法采用Fmoc固相合成法,根据设计的序列合成寡聚精氨酸穿膜肽(R6),以脱水缩合法将其与钴原卟啉(cobalt protoporphyrin,CoPP)连接,使用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocvanate,FITC)进行标记。应用高效液相色谱仪和质谱仪测定其纯度和相对分子质量,利用扫描透射电镜(STEM)能谱面/线扫和激光纳米粒度电位测量仪观测其表征形貌、元素分布、粒子直径和表面电位;细胞流式仪和共聚焦显微镜观察R6-CoPP对体外培养的人晶状体上皮细胞系的穿膜效果;CCK-8法检测R6-CoPP对人晶状体上皮细胞系细胞活性的影响。利用H_(2)O_(2)构建晶状体上皮细胞氧化损伤模型,比较R6-CoPP与CoPP预处理对细胞凋亡的影响。结果经高效液相色谱法鉴定R6-CoPP纯度为94.56%,质谱鉴定相对分子质量为2109.75,与预计相符,粒径为227.8 nm,表面电位为+13.9 mV,STEM能谱面扫显示R6-CoPP内有钴元素分布。R6-CoPP对细胞毒性较小,生物相容性好。细胞流式结果显示穿膜肽药物孵育细胞2 h后荧光阳性细胞比例可达80%以上。共聚焦显微镜荧光显示孵育15 min后R6-CoPP已经穿越细胞膜进入细胞质,细胞荧光强度随孵育时间的增加而下降。与氧化损伤模型组相比,CoPP和R6-CoPP预处理后的细胞存活率明显提高(P<0.05)。结论穿膜肽药物复合体R6-CoPP生物相容性较好,具有较强的细胞膜穿透能力,体外实验显示其可减轻氧化损伤所致的晶状体上皮细胞凋亡。

摘要：采用乳化溶剂挥发法、基因重组和蛋白纯化技术,制备了穿膜肽修饰的3-羟基丁酸-3-羟基己酸共聚酯(PHBHHx)负载紫杉醇(PTX)递药系统。通过调控乳化剂的种类、用量、包封材料与药物比例优化了纳米微球的尺寸、药物包封率及载药量,并对递药系统的尺寸、形貌进行了表征。结果表明:水包油型乳化剂选用0.5 mL的吐温-20、水相乳化剂选用60 mL(1%)聚乙烯醇,微球尺寸达到150 nm左右时,均匀性良好;PTX与PHBHHx比例为1∶50时,药物包封率及载药量达到最优,分别为81.02%和50.9 mg/g;递药系统分散度好,表面略显粗糙,基本呈球形,粒径约为150 nm。在最优条件下制备的PTX载药系统粒径较小,包封率较高,易实现功能化蛋白修饰,为PTX纳米药物提供了一种新的设计思路。

摘要：穿膜肽是一类可以穿透细胞膜的小分子多肽,它可以高效的负载si RNA、功能性蛋白质、小分子药物以及其他功能多肽片段进入细胞。研究者们以肿瘤组织中的高浓度基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)、过表达的受体以及酸性微环境为靶点,对穿膜肽进行结构改造,设计合成了一系列具有肿瘤靶向性的穿膜肽衍生物。这些衍生物可以负载一些传统的抗肿瘤药物分子,将他们高效地靶向到肿瘤细胞,使药物富集在肿瘤组织周围,这样既降低了药物对正常组织的毒性,又提高了药物的利用率。本文对靶向穿膜肽的设计合成以及其在抗肿瘤方面的研究进展进行了阐述。

摘要：目的人工设计合成穿膜肽新序列(CGRLWMRWYSPWARRYGC),并于体外考察其作为基因载体的潜力。方法采用Na-芴甲氧羰基(Fmoc)法固相合成穿膜肽新序列,并用异硫氰酸荧光素(FITC)标记N端。高效液相色谱及质谱仪检测其纯度及相对分子质量,流式细胞仪及共聚焦显微镜观察其穿膜能力,荧光显微镜和流式细胞仪观察其携带增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)进入细胞表达情况,MTT评价穿膜肽与质粒复合物的细胞毒性,琼脂糖凝胶电泳检测穿膜肽与质粒的亲和力及对质粒的保护作用。结果合成的穿膜肽纯度为96.13%,相对分子质量为2 348.42,流式细胞仪检测显示荧光阳性细胞平均约占98.81%,共聚焦显微镜可见荧光标记的穿膜肽分布于细胞内;穿膜肽携带质粒在人脐静脉内皮细胞中的表达率平均约为11.44%;不同电荷比的复合物对细胞的活性没有明显影响(P>0.05);琼脂糖凝胶电泳显示当穿膜肽与质粒的电荷比大于2∶1时,质粒不能迁移出来,电荷比为4∶1、8∶1和16∶1的复合物能够抵抗DNA酶Ⅰ的消化作用,以8∶1最为明显。结论人工设计合成的新型穿膜肽能够作为一种潜在的基因运输载体。

摘要：目的:利用穿膜肽人免疫缺陷病毒(HIV)-Tat49-57的穿膜能力,设计穿膜肽人乳头瘤病毒(HPV)16E7限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位(第49～57位氨基酸)的融合肽疫苗,并在体外研究其诱导特异性CTL的应答能力。方法:应用多肽固相合成技术,分别合成含HIVTat49-57和人类白细胞抗原(HLA)-A2.1限制性CTL优势表位HPV16E749-57的18肽,和该CTL表位的9肽,并用一无关肽作对照,在体外用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验分别检测了上述18肽和9肽在HLA-A2阳性健康者外周血单个核细胞(PBMC)中诱导的表位E749-57的特异性CTL活性。结果:经质谱分析,上述多肽成功合成,纯度均在95%以上。与9肽相比,18肽能在体外诱导出明显增强的特异性CTL活性(P<0.05)。结论:在HPV16E7HLA-A2.1限制性CTL表位(49～57)的N-末端加上HIV-Tat49-57序列,不会影响表位的提呈效率,而且在体外能有效激发针对E749-57特异性的CTL应答,为新型抗肿瘤及细胞内感染的多肽疫苗设计提供了新思路。

摘要：基于细胞穿膜肽Tat(49-57)N端二肽修饰设计了4条阳离子型抗菌肽Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)和Tat(FF),并通过Fmoc多肽固相合成法进行合成,反相高效液相色谱分离纯化,经~1H NMR、ESI-MS和元素分析对其结构进行表征,采用噻唑蓝(MTT)法测定其抑菌活性,利用多种光谱法研究其与小牛胸腺DNA(ct-DNA)的相互作用.MTT实验结果表明,Tat(YY)、Tat(FF)、Tat(FF)和Tat(YY)、Tat(FF)分别对大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制效率最高的,且抗菌肽的溶血性都很小,但对真菌的增长没有明显抑制作用.与DNA的结合实验结果表明:Tat(49-57)及其衍生肽与DNA相互作用的主要模式是沟槽模式,衍生肽与DNA的相互作用能力增强,具有进一步改善设计成为优异抗菌药物的价值.

摘要：小肽及其类似物在生命活动中发挥着至关重要的作用.开发高效、安全的小肽胞内递送技术对于生物医药以及生命科学基础研究都具有重要意义.当前,将不同性质的小肽高效递送到细胞中并使其发挥生物学功能仍然面临挑战.本文通过在树形高分子表面修饰苯硼酸基团得到一种小肽胞内递送载体.该载体可以将不同极性和带电性质的小肽高效、安全地递送到多种细胞系中.与传统的穿膜肽相比,该方法对小肽的递送效率更高,同时能够更加有效地保护小肽避免其被蛋白酶降解,维持其生物学活性.通过该研究,我们得到了一种高效、通用的小肽胞内递送方法,为小肽递送载体的理性设计提供了新的思路.

摘要：目的筛选细胞穿膜肽(transcription activator,TAT)和聚乙二醇(polyethylene glycols,PEG)双修饰田蓟苷复合磷脂脂质体(TAT&PEG tilianin CPL,T&PTCPL)的最佳制备工艺,并考察其对心肌细胞H9C2的保护作用。方法采用薄膜分散-超声法制备T&PTCPL,利用3因素3水平的Box-Behnken设计,分别以总磷脂与田蓟苷质量比(X1)、DSPEPEG2000-TAT的浓度(X2)和水化体积(X3)为考察对象,包封率(Y1)、粒径(Y2)和多分散系数(PDI,Y3)为主要评价指标筛选T&PTCPL最佳配方,并以Na2S2O4建立H9C2细胞缺氧/复氧损伤模型,以超氧化物歧化酶(SOD)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)和乳酸脱氢酶(LDH)为指标,考察T&PTCPL对细胞缺氧/复氧损伤的影响,同时,考察其体外释放率(动态透析法)及人结肠癌Caco-2细胞对田蓟苷原料药和T&PTCPL的吸收情况。结果 T&PTCPL的最佳组合为X1=20,X2=1.7%,X3=3.2m L;包封率为(86.62±2.51)%,粒径为(149.7±8.2)nm,PDI为0.15±0.05。在体外细胞实验中,与模型组比较,原料药组及T&PTCPL组能显著提高SOD活性,减少MDA的含量及抑制LDH和CK-MB的释放(P<0.05),并且T&PTCPL的效果优于原料药。同时,T&PTCPL在48 h基本释放完全,累积释放率88.65%,Caco-2细胞对T&PTCPL的吸收效果较佳。结论 Box-Behnken实验设计法用于T&PTCPL的优化筛选是可行的,数学模型的预测值与实验观察值相符,并且T&PTCPL在体外释放中表现出较好的缓释效果,能促进田蓟苷在Caco-2细胞中的吸收,同时,提示T&PTCPL具有保护心肌缺血再灌注损伤作用。

摘要：目的构建穿膜肽基因和BACE底物肽融合基因与绿荧光融合基因慢病毒载体,为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗奠定基础。方法利用非对称互补引物/模板法制备两端含有酶切位点的TAT-BACEsp融合基因的cDNA,使之克隆到带GFP慢病毒表达载体质粒FUGW中,经限制性酶切和测序鉴定重组载体。结果限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实获得的TAT-BACEsp产物与设计的完全吻合;TAT-BACEsp准确克隆入FUGW的多克隆位点。结论成功构建了TAT-BACEsp与GFP融合基因慢病毒载体,为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗提供了适合的稳定转染的载体。

摘要：目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)core对肝细胞的转分化作用,构建可以表达HCV core-Ant融合蛋白的原核表达载体.方法:已经构建的HCV core cDNA克隆质粒为模板,用PCR技术删除终止子,通过T载体克隆法构建pGEM-T-HCV core cDNA克隆质粒.经筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序后,通过常规分子生物学亚克隆方法,利用已有的pGEMT-Ant载体,连接Ant和HCV core cDNA在同一ORF,插入到pTE28表达载体,建立了表达HCV core和果蝇穿膜肽Ant的融合蛋白表达克隆.使用IPTG诱导方法,从表达菌中提取包涵体蛋白,复性后使用ELISA方法检测表达蛋白的抗原性.使用HRP标记的抗HCV核心抗体免疫组织化学一步法检测HCV core和HCV core-Ant融合蛋白对NIH 3T3细胞的转导能力.结果:pGEM-T-HCV core-Ant cDNA克隆的酶切物理图谱及测序证实结果证实建立了果蝇穿膜肽Ant cDNA克隆和删除了终止子的HCV core cDNA克隆.亚克隆后建立的重组质粒pTE28HCV coreAnt经限制性内切酶后,琼脂糖凝胶电泳,结果显示酶切片段大小和设计预计值一致.序列测定结果表明HCV core cDNA和穿膜肽Ant cDNA处于同一ORF.通过转化BL21 DE3表达菌,IPTG诱导后,PAGE电泳成功表达了HCV core-Ant蛋白.复性后包被酶标板,间接ELISA方法检测抗HCV抗体阳性血清和正常人血清证实表达蛋白具有敏感和特异的抗原性.目标蛋白能转导进入NIH 3T3细胞显示了大量的阳性着色细胞.这些阳性着色细胞的着色颗粒主要存在细胞质中.表明构建表达HCV core-Ant融合蛋白的pET28原核表达载体成功.结论:通过分子克隆体外重组技术成功建立了表达HCV core-Ant的pTE28原核表达载体,为研究HCV core对细胞的转分化作用和HCV的致癌机制奠定了基础.