摘要：目的　有效抑制肿瘤细胞端粒酶活性 ,为肿瘤的基因治疗提供依据。方法　设计合成了针对端粒酶逆转录酶 m RNA5′端区的锤头状核酶 (5′- end of human telomerase reverse trascriptase m RNA,h TERT- 5′RZ)基因 ,并将该基因重组入 pc DNA3.1(+) ,经体外转录得到小片段 h TERT- 5′RZ。用脂质体介导法 ,将 h TERT- 5′RZ导入 He L a细胞以检测其对 He L a细胞端粒酶活性的抑制效力。同时比较了同法合成的针对端粒酶 RNA模板的核酶 (telomerase m RNA,telo RZ)和两种核酶混合物对 He L a细胞端粒酶活性的抑制效力。结果　小片段 h TERT- 5′RZ能有效抑制 He L a细胞端粒酶活性 ,且其抑制效力较单纯telo RZ为高 ,两种核酶混合物的端粒酶抑制效力与 h TERT- 5′RZ相当 ,也高于单纯 telo RZ。结论　小片段核酶 h TERT- 5′RZ可望成为优于 telo RZ的端粒酶抑制剂 ,在肿瘤基因治疗中发挥作用。

摘要：目的设计人端粒酶逆转录酶(h T E R T)的新型病毒样颗粒疫苗,并研究其抗肝癌的作用。方法以阳离子抗原肽为桥梁,将人粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子和h T E R T克隆入真核双表达载体 p T C A E中,再将多肽和核酸疫苗结合于同一疫苗颗粒,转染并鉴定其免疫原性,评价其转染效率,并观察其免疫转基因小鼠后激发特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应的有效性。结果该疫苗可激发特异性 CTL反应,并对肝癌细胞具有特异性杀伤活性。结论成功构建了具有特异性CTL杀伤活性的hTERT肽核酸病毒样颗粒疫苗,为进一步探索其体内抗肝癌免疫作用奠定了基础。

摘要：目的:设计人端粒酶逆转录酶(hTERT)的新型病毒样颗粒疫苗,并鉴定其表达蛋白的免疫原性和疫苗转染效率．方法:合成阳离子抗原肽K18P9,同时将人粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)和hTERT克隆入真核双表达载体pTCAE中,再将多肽和核酸疫苗结合于同一疫苗颗粒,并将其转染入真核细胞内.ELISA法和免疫印迹法检测hGM-CSF和hTERT的免疫原性,同时评价疫苗的转染效率．结果:酶切及测序结果证实已成功构建含hGM-CSF和 hTERT的载体pTGH,电镜等结果证实核酸被包装肽包裹形成病毒样颗粒,ELISA法和免疫印迹法证实疫苗在体外对真核细胞的转染效应以及hGM-CSF和hTERT 的免疫原性,与阳性对照DOTAP组比较,疫苗转染效率约可达78．5％．结论:成功构建了具有免疫原性的hTERT肽-核酸病毒样颗粒疫苗．

摘要：目的:探讨人端粒酶反转录酶(hTERT)修饰的内皮祖细胞(EPCs)移植对SD大鼠缺血肢体治疗机制和规律。方法:EPCs原代培养及鉴定后,脂质体法将PLXSN-hTERT稳定转染EPCs,Western blot鉴定外源hTERT基因在内皮祖细胞中的表达。64只雄性SD大鼠随机单位组设计分为4组:缺血对照组(A组)、hTERT治疗组(B组)、EPCs治疗组(C组)、转染hTERT基因的EPCs治疗组(D组),每组16只。结扎大鼠左股动脉及分支,构建后肢缺血模型。于内收肌和腓肠肌共注射5点,每点注射60μL,A组注射300μL培养液,B组注射DNA-脂质体复合物,C组注射4×10~6个EPCs,D组注射4×10~6个含hTERT基因的EPCs。于移植后4周行动脉造影,采用RT-PCR检测hTERT基因的体内表达,评价血管新生情况;荧光显微镜观察PKH-26标记的EPCs存活情况。结果:64只大鼠均造模成功。Western blot结果显示转染人hTERT基因的人内皮祖细胞体外能表达hTERT。移植后4周动脉造影显示,A组大鼠股动脉及其分支均未显影,B组和C组可见中等量新生血管,两组效果相似,C组可见有大量新生血管及丰富的侧枝循环建立。B组和C组均较A组新生血管数量增加,D组可进一步增强疗效PKH-26阳性细胞数:ABCD四组分别为[(0±0.00),(0±0.00),(27.46±5.48),(54.37±8.34)]个/HP;P<0.05。RT-PCR检测hTERT基因的体内表达,D组和B组均有扩增,D组hTERT mRNA相对含量高于B组。D组和B组hTERT mRNA相对含量分别为(0.89±0.06,0.29±0.04;P<0.05)。结论:通过人端粒酶反转录酶(hTERT)修饰的内皮祖细胞(EPCs)移植治疗大鼠肢体缺血,可以让hTERT基因稳定有效持续的表达,其效果优于直接基因注射。

摘要：【目的】探讨肝癌患者血清端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)mRNA表达水平及对肝癌的临床应用价值。【方法】设计人端粒酶逆转录酶基因引物和实时荧光PCR相对定量法反应体系,在ABI7500实时荧光PCR仪上检测45例肝癌患者,52例病毒性肝炎患者,29例肝硬化患者和58例健康人血清端粒酶逆转录酶mRNA表达水平并分析其差异。【结果】肝癌患者血清hTERT mRNA水平明显高于肝炎、肝硬化患者及健康人。肝癌患者血清hTERT mRNA相对表达量与肿瘤大小和分化等级及分期明显相关,与年龄、性别、以及肿瘤数量无明显关联。【结论】肝癌患者血清hTERT基因表达上调,其升高程度与肿瘤分化与进展相关,检测血清hTERT基因表达水平有助于肝癌的诊断和研究。

摘要：目的探索联合RNA干扰TR及TERT[小型干扰RNA（siRNA）、人端粒酶RNA（hTR）及人端粒酶逆转录酶（hTERT）]基因对膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87端粒酶活性及其增殖的影响。方法根据hTRmRNA和hTERTmRNA的序列，分别设计合成3对不同的且能干扰TR和TERT基因表达的siRNA并筛选出最高效抑制序列（pRNAT—TR—Ⅲ、pRNAT-TERT-Ⅲ），构建以hTR、hTERT基因为靶点的联合RNA干扰装置***—Ⅲ、pRNAT—TERT—Ⅲ（脂质体法）并将其转染BIU-87细胞株，采用荧光定量PCR分析hTR及hTERTmRNA表达，TRAP-ELISA检测端粒酶活性，MTT法检测细胞增殖。结果分别及联合RNA干扰hTR及hTERT基因后，pRNAT—TERT—Ⅲ，pRNAT—TR-Ⅲ及pRNAT—TERT-Ⅲ、pRNAT—TR-Ⅲ的联合干扰可以特异性抑制BIU-87细胞株中TERT和TR表达（分别减少pRNAT—TERT-ⅢTERTmRNA：67％、pRNAT—TR-ⅢTRmRNA：41％、pRNAT—TERT—Ⅲ、pRNAT—TR—ⅢTRmRNA：57％、pRNAT—TERT-Ⅲ、pRNAT—TR—Ⅲ TERTmRNA：70％，P〈0．05）。且膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87的生长和端粒酶活性均明显受到抑制，以联合RNA干扰尤为明显（pRNAT—TERT-Ⅲ：1．80±0．014，pRNAT—TR—Ⅲ：1．95±0．016，pRNAT—TERT-Ⅲ、pRNAT—TR-Ⅲ：1．25±0．012，P〈0．05）。结论联合RNA干扰hTERT及hTR基因能更明显抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长，为其临床应用奠定了基础。

摘要：背景与目的:人类端粒酶逆转录酶催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)的表达与端粒酶活性成正相关。hTERT的转录过程存在选择性剪接,肿瘤演进中可能呈现特定剪接模式的转换。本实验检测正常胃粘膜、胃癌前病变、胃癌组织中hTERT选择性剪接变异体(alternative splicing variants,ASVs)的表达,揭示胃癌多阶段演变过程中hTERT选择性剪接模式的变化。方法:在hTERT前体mRNA的三个选择性剪接位点(α、β、γ)内或横跨位点设计引物,采用半巢式RT-PCR特异性扩增8个hTERT ASVs,琼脂糖凝胶电泳检测正常胃粘膜、胃癌前病变、胃癌组织中ASVs的阳性率;采用SYBR Green实时定量RT-PCR法检测胃癌和胃癌前病变组织中β+hTERT mRNA(β位点保留的ASVs)的表达水平。结果:α+β+γ+hTERT mRNA在正常胃粘膜中不表达,在胃癌组织中阳性率比癌前病变组织高(P<0.05);β缺失型ASV在正常胃粘膜、胃癌前病变和胃癌组织中的阳性率分别为72.2%、95.0%、100.0%;β位点保留的ASVs(α+β+γ+hTERT mRNA、α缺失型ASV、γ缺失型ASV、αγ缺失型ASV)在正常胃粘膜、胃癌前病变、胃癌组织中的阳性率分别为11.1%、40.0%、94.7%,三组间差异具有统计学意义(P<0.05)。荧光实时定量RT-PCR显示,胃癌中β+hTERT mRNA表达水平比癌前病变高6.99倍。结论:胃癌多阶段演变hTERT选择性剪接模式不同,β+hTERT mRNA在胃癌多阶段演变过程中表达水平逐步升高,提示β+hTERT mRNA的检测可能为胃癌及胃癌前病变的诊断提供参考依据。

摘要：为了检测梅花鹿鹿茸顶端组织不同部位的端粒酶活性及端粒酶逆转录酶(TERT)基因的mRNA表达水平,分离鹿茸顶端组织的茸皮层、间充质层及软骨层,并进行细胞培养,利用TRAP银染法测定不同部位的端粒酶活性。再利用TRIzol试剂法分别提取茸皮层、间充质和软骨细胞的总RNA,逆转录合成cDNA。根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿TERT基因部分序列特异引物并克隆TERT基因,采用相对荧光定量Real-time PCR法检测TERT在鹿茸顶端不同部位细胞的表达丰度。结果表明:在鹿茸顶端组织茸皮层、间充质层和软骨层均检测到了端粒酶活性,其中间充质层的端粒酶活性最高,软骨层次之,茸皮层端粒酶活性最低;而体外培养的不同代数间充质细胞的端粒酶活性无明显差异。成功获得了鹿茸组织TERT基因部分编码区cDNA序列,该基因长915 bp,编码305个AA;与牛、羊TERT基因进行同源性分析显示,核苷酸序列分别为94.89%和94.31%;氨基酸序列分别为92.16%和92.11%。相对荧光定量PCR差异分析发现,TERT基因在鹿茸顶端不同部位组织均有表达。其中,在间充质组织的表达水平高于软骨和茸皮层组织。

摘要：目的: 设计hTERTI540 PTD融合基因表达框并构建携带该表达框的穿梭质粒.方法: 根据hTERTI540表位、HIV 1TAT PTD和PTD4的氨基酸序列设计融合疫苗,然后根据哺乳动物偏爱密码子反翻译成基因序列.分段合成寡聚脱氧核糖核酸,磷酸化、退火后先后克隆至pSP72的BamHI EcoRI和XbaI BanHI之间.将经双酶切鉴定获得的阳性重组子进行基因测序.然后将hTERTI540 PTD融合基因表达框亚克隆至pDC315.结果: 测序结果表明hTERTI540 PTD和hTERTI540 PTD融合表达框的基因序列与设计完全一致.穿梭质粒pDC315 I540 PTD和pDC315 I540 PTD4经EcoRI酶切后均清晰可见 112bp电泳条带,与预测相符.结论: 成功获得了携带hTERTI540 PTD和hTERTI540 PTD4表达框的穿梭质粒pDC315 I540 PTD和pDC315 I540 PTD4,为制备以重组腺病毒为载体的I540 PTD基因疫苗、比较蛋白转导能力的强弱对基因疫苗免疫效能的影响奠定了基础.

摘要：目的:构建携带人端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)I540-PTD,I540-PTD4融合基因表达框的重组复制缺陷型腺病毒.方法:将pDC315-I540-PTD,pDC315-I540-PTD4与腺病毒基因组质粒pBHGloxdeltaE13Cre共转染HEK293细胞,出现典型的细胞病变反应后收获细胞,反复冻融法制备病毒粗提液,经扩增和纯化获得重组复制缺陷型腺病毒Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4.使用终点稀释实验和空斑形成实验测定纯化后病毒滴度.采用聚合酶链式反应(PCR)对Ad-I540-PTD,Ad-I540-PTD4进行鉴定.使用病毒感染人骨肉瘤U2OS细胞后,进行免疫组化定性并观察I540-PTD,I540-PTD4的表达情况.结果:共转染10d后,HEK293细胞出现典型的细胞病变反应.经扩增、纯化后,终点稀释法和孔板形成法测定Ad-I540-PTD滴度分别为(8.9×1012),(6.3×1012)pfu/L;Ad-I540-PTD4滴度分别为(5.8×1012),(5.4×1012)pfu/L.以纯化的病毒为模板,使用自行设计的鉴定引物进行PCR均获得167bp目标片段.抗组胺酸标签抗体对病毒感染后的U2OS细胞免疫组化分析发现Ad-I540-PTD,Ad-I540-PTD4转染的U2OS细胞均呈强染,表明Ad-I540-PTD,Ad-I540-PTD4中携带的I540-PTD,I540-PTD4真核表达读框可在人类细胞内高效表达.结论:成功构建可高效表达I540-PTD,hTERTI540-PTD4的重组复制缺陷型重组腺病毒Ad-I540-PTD,Ad-I540-PTD4,为其作为基因疫苗诱发针对hTERT I540表位的抗瘤免疫奠定了基础.