摘要：高分子多孔微球在医药领域的分离纯化中应用广泛,是重要的化工产品。高分子多孔微球的形成是一个复杂的过程,利用聚合物与有机溶剂致孔剂的相分离,可得到小于100 nm孔径的多孔微球;而水和疏水性聚合物之间相分离程度远大于有机溶剂与聚合物间的相分离程度,因此可获得大于100 nm孔径的多孔微球。针对不同应用领域选择不同的方法,设计并制备出合理的微球结构,对多孔微球的实际应用十分关键。本综述介绍了纳孔、介孔、大孔微球产品的制备方法悬浮聚合和种子聚合法,重点介绍本课题组制备超大孔微球的方法——反胶团溶胀法和W/O/W复乳法,上述两种方法解决了常规方法难以制备大孔径微球产品的问题,拓展了多孔微球在类病毒颗粒等大尺寸蛋白分离纯化领域的应用。在此基础上,以HB-VLPs为模型对比了不同孔径微球对类病毒颗粒吸附量、回收率、结构、以及纯化效果的差异,揭示超大孔微球产品在类病毒颗粒分离纯化中的优势。

摘要：研究表明,口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的VP1蛋白含有关键的抗原决定簇.根据O/HL-JOC12/03猪源FMDV毒株VP1上第141～160位氨基酸序列设计引物,利用重叠延伸PCR(SOE PCR)技术将该序列插入在大肠杆菌(Escherichia coli)噬菌体MS2外壳蛋白基因的特定位点.然后连接到原核表达载体pET28a上,构建了重组表达质粒28a-CP-VP1,转化BL21(DE3),ITPG诱导表达得到融合表达的CP-VP1.透射电子显微镜下观察融合蛋白CP-VP1成类病毒颗粒(virus-like particles,VLPs)状.间接ELISA实验证实该蛋白能够特异地结合豚鼠抗O型FM-DV的阳性血清,30μg的CP-VP1的VLPs蛋白免疫小鼠后可以诱导其产生高效价的特异抗体.故该口蹄疫病毒抗原决定簇展示在噬菌体MS2上表面的VLPs蛋白具有开发成口蹄疫疫苗的前景.

摘要：猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2,PCV2)衣壳(Capsid)蛋白是制备抗猪圆环2型病毒亚单位疫苗的有效免疫抗原,能在大肠杆菌及杆状病毒/昆虫细胞表达系统中获得表达,然而在哺乳细胞中的表达研究仍然缺乏。瞬时表达条件考察结果显示,采用宿主HEK293F细胞及PEI-40kDa转染试剂能获得35%病毒PCV2 Capsid基因细胞转染效率。转染试剂PEI(Polyethylenimine)与DNA比例差异会影响复合物形成大小及形态,复合物形成15~80 nm颗粒有利于转染效率的提高。实验以免疫逃逸型猪圆环病毒2b型NDSU41513病毒株,设计了新型PCV2 Capsid (△1-41aa)-Fc(pig) protein(PCFP)分子。在3 L反应器中成功实现了HEK293F细胞瞬时表达PCFP,表达水平达到3.8 mg/L。PCFP蛋白能够自主装形成约为41 nm类病毒颗粒,诱导小鼠机体内产生强烈的体液免疫反应,具有很高的应用潜力。

摘要：为提高HBVpreS1aa21 47的免疫原性,将1～6拷贝的preS1(21 47)片段以串联方式插入HBcAg的aa78和aa82之间,在大肠杆菌中进行表达和纯化.携带1～3拷贝的重组抗原CI、CII和CIII的表达产量约占菌体总蛋白的20%,而携带4～6拷贝的重组抗原则未见明显表达.电镜检测显示重组抗原CI、CII和CIII可以形成形态与HBcAg类似的类病毒颗粒,颗粒直径在30～34nm之间.ELISA分析显示这3种VLP抗原具有很强的preS1抗原的免疫反应性,而对HBc单克隆抗体则基本失去反应性.提示外源多肽pre(21 47)可被有效地递呈至类HBc颗粒的表面,且外源多肽的插入使HBc主要的免疫优势表位遭到了破坏.这些证据表明利用HBcAg的专一性呈递能力来构建多价抗原可作为免疫原设计时的一种策略.

摘要：目的通过克隆EV71病毒结构前体蛋白P1和非结构蛋白3CD,构建共表达P1前体蛋白和非结构蛋白3CD的重组杆状病毒表达载体。方法设计合成EMCV病毒IRES序列的特异性引物,克隆至含有CMV启动子的杆状病毒穿梭载体pFastBacDual-CMV上,命名为pFBCMV-IRES。从手足口病重症患者分离EV71病毒株,经RT-PCR技术分别扩增出EV71病毒的P1前体蛋白区与3CD区的片段,定向克隆至杆状病毒穿梭载体pF-BCMV-IRES的IRES序列的上游和下游,随后转化到大肠杆菌DH5α中,经PCR和双酶切鉴定转化菌落。结果通过对重组杆状病毒穿梭载体pFBCMV-IRES-P1-3CD进行酶切和DNA序列分析,证明共表达EV71病毒P1和3CD基因的重组杆状病毒双顺反子穿梭载体构建成功。结论共表达EV71病毒P1和3CD基因重组杆状病毒双顺反子穿梭载体的成功构建,将为下一步制备EV71病毒的类病毒颗粒疫苗打下基础。

摘要：目的通过克隆肠道病毒71型结构前体蛋白P1和非结构蛋白3CD,构建共表达P1前体蛋白和非结构蛋白3CD的真核双基因表达载体。方法设计合成脑心肌炎病毒(EMCV)IRES序列的特异性引物,克隆至真核表达载体pcDNA3.0上,命名为pc-IRES。从手足口病重症患者分离EV71病毒株,经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术分别扩增出EV71病毒的P1前体蛋白区与3CD区的片段,并将其定向克隆至真核表达载体pc-IRES载体中IRES序列的上游和下游,随后转化到大肠埃希菌DH5α中,最后经PCR和双酶切鉴定转化菌落。结果通过重组质粒p-IRES-P1-3CD进行酶切和DNA序列分析,重组真核双基因表达载体p-IRES-P1-3CD构建成功。结论成功构建共表达EV71病毒P1前体蛋白和非结构蛋白3CD真核双基因表达载体,这将为下一步制备基于DNA载体的EV71病毒的类病毒颗粒疫苗打下基础。