摘要：本试验旨在研究饲粮锌缺乏对22~42日龄肉仔鸡生长性能、小肠形态、屏障功能及空肠中紧密连接蛋白mRNA表达的影响。试验选用140只1日龄爱拔益加肉仔鸡公雏,1~21日龄统一饲喂正常添加七水合硫酸锌(ZnSO 4·7H 2O)的试验饲粮(实测锌含量为84.40 mg/kg);22日龄时,从中选取体重接近的112只肉仔鸡,采用单因子完全随机试验设计,随机分为2组(每组7个重复,每个重复8只鸡),对照组饲喂满足肉仔鸡锌需要量的试验饲粮(基础饲粮中添加40 mg/kg锌,实测锌含量为64.36 mg/kg),锌缺乏组饲喂不添加锌的试验饲粮(基础饲粮中不添加锌,实测锌含量为22.23 mg/kg)。试验期42 d。结果表明,与对照组相比:1)锌缺乏组22~42日龄肉仔鸡料重比显著增加(P<0.05);2)锌缺乏组42日龄肉仔鸡十二指肠和空肠隐窝深度显著增加(P<0.05),42日龄肉仔鸡十二指肠、空肠和回肠绒毛高度/隐窝深度以及空肠绒毛高度和绒毛表面积显著降低(P<0.05);3)锌缺乏组42日龄肉仔鸡翅静脉和肝门静脉血清二胺氧化酶活性和异硫氰酸荧光素-葡聚糖含量显著增加(P<0.05);4)锌缺乏组42日龄肉仔鸡空肠中黏膜闭合蛋白-1(Claudin-1)的mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。综上所述,饲粮锌缺乏可能通过降低紧密连接蛋白Claudin-1的mRNA表达而损伤肉仔鸡小肠黏膜完整性和屏障功能,进而降低其饲料转化效率。

摘要：目的 探讨十三味辛夷滴鼻剂对鼻腔黏膜损伤小鼠的修复作用及其可能的干预机制。方法 制备小鼠鼻腔黏膜热损伤模型,随机分为空白对照组、模型对照组、滴通鼻炎水阳性对照组[1μl/(只·次·侧)]、十三味辛夷滴鼻剂高剂量[5μl/(只·次·侧)]、中剂量[2.5μl/(只·次·侧)]、低剂量组[1.25μl/(只·次·侧)],每组各10只,雌雄各半。给药7 d后,分级评价鼻黏膜红肿程度,苏木素-伊红(HE)染色观察鼻黏膜组织病理结构改变,免疫组化分析鼻黏膜上皮ZO-1、Claudin-1、Occludin表达水平。结果 给药7 d后,模型对照组红肿程度评分显著高于空白对照组(P <0.05),滴通鼻炎水阳性对照组、十三味辛夷滴鼻剂高、中、低剂量组均低于模型对照组;HE染色显示,十三味辛夷滴鼻剂各组随剂量增高,黏膜层逐渐变薄、黏膜结构趋于整齐;与模型对照组比较,十三味辛夷滴鼻剂高剂量组ZO-1、Claudin-1、Occludin蛋白表达量显著提高(P <0.05)。结论 十三味辛夷滴鼻剂可能通过上调鼻黏膜上皮紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin的表达,修复小鼠鼻腔黏膜损伤。

摘要：紧密连接蛋白有维持上皮屏障完整性的功能,主要的组成蛋白有occludin和claudin-1。为研究猪体内紧密连接蛋白occludin和claudin-1的表达分布情况,首先用Gen Bank中发表的猪源occludin和claudin-1的序列,设计并合成了针对occludin和claudin-1的特异性引物,然后从无特定病原(SPF)猪体不同组织中提取总RNA,反转录成c DNA,用半定量方法测定SPF猪不同组织紧密连接蛋白的m RNA水平。结果发现,occludin和claudin-1在不同组织的分布存在差异。进一步测序发现,occludin序列相对保守,而claudin-1则变异较大。

摘要：目的 研究肠道黏膜通透性在IBS致病过程中的作用机制和评价酪酸杆菌联合谷氨酰胺干预的作用.方法 50只BALB/c小鼠按随机数字法均分为空白对照组、实验对照组、谷氨酰胺组、酪酸杆菌组和联合干预组5组,避水试验诱导建立应激IBS小鼠模型.1.5％甲基纤维素灌胃染色粪便法检测小鼠排便时间和粪便含水量,HE染色法评价肠道病理损伤,结肠膨胀试验检测内脏敏感性.检测血清D-乳酸、二胺氧化酶水平和肠上皮细胞间紧密连接蛋白[闭锁蛋白-1、胞质附着蛋白、紧密连接相关蛋白跨膜蛋白（ZOL-1）]蛋白水平变化评价空肠通透性改变,评价酪酸杆菌联合谷氨酰胺干预的影响.组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析.结果 与空白对照组相比,实验对照组小鼠排便时间[（100.40±14.80） min比（75.88±12.20） min]明显缩短、粪便含水量[（54.76±9.98）％、（74.95±7.15）％]增加明显（t＝3.692、4.023,P＝0.002、0.002）,最低阈值显著降低[（40.87±4.82） mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）比（27.80±3.18） mmHg;t=8.761,P＜0.01],空肠黏膜损伤评分增加（0.50±0.15比2.60±0.97;t＝6.034,P＜0.01）;肠道通透性包括血清D-乳酸[（913.6±90.1） ng/L比（1 476.0±246.8） ng/L]、二胺氧化酶[（3 391.0±256.9） ng/L比（5 096.0±725.2） ng/L]水平显著增加（t＝40.920、29.810,P均＜0.05）,紧密连接蛋白ZOL-1 （0.165±0.005、0.119±0.003）、闭锁蛋白1（0.104±0.016比0.022±0.006）表达显著降低（t=19.830、19.830,P均＜0.01）.与实验对照组相比,谷氨酰胺组、酪酸杆菌组和联合干预组经灌胃干预后,排便时间增加[（90.50±3.78）、（97.56±8.79）、（99.89±11.90） min]、粪便含水量降低[（69.33±6.71）％、（58.07±8.97）％、（56.74±8.12）％],差异有统计学意义（F=10.020、8.740,P均＜0.01）,而酪酸杆菌组和联合干预组效果最佳（F＝2.481、4.874,P均＜0.05）;最低阈值显著增高[（31.80±2.69）、（36.04±5.06）、（38.93±3.30） mmHg,F＝2.420,P＜0.05）],联合干预组效果最佳（F＝ 3.550,P＜0.01）;空肠黏膜损伤明显减轻（2.00±0.94、1.30±0.68、1.30±0.48,F＝ 11.350,P＜0.01）.谷氨酰胺组、酪酸杆菌组和联合干预组经灌胃干预后,血清中D-乳酸[（1 370.0±78.9）、（1 066.0±155.5）、（1 039.0±129.0）ng/L],二胺氧化酶[（4 808.0±477.4）、（3 713.0±595.0）、（3 725.0±615.9） ng/L]水平均显著降低（F=37.480、27.670,P均＜0.01）.谷氨酰胺组、酪酸杆菌组和联合干预组ZOL-1水平（0.126±0.014、0.125±0.006、0.138±0.004）及闭锁蛋白-1（0.037±0.013、0.073±0.028、0.078±0.027）水平明显增加,差异均有统计学意义（F=5.867、10.630,P均＜0.05）;联合干预组ZOL-1改善程度优于酪酸杆菌组（t＝5.457,P＜0.05）.结论 避水试验诱导小鼠内脏高敏状态和肠道通透性增加,降低肠上皮屏障功能,酪酸杆菌和谷氨酰胺能够较好地恢复内脏敏感性及肠黏膜上皮通透性.

摘要：本试验旨在采用体外法研究p H与脂多糖(LPS)或组胺(HIS)的交互作用对奶山羊瘤胃上皮细胞紧密连接蛋白mRNA表达量的影响。选用8只体况良好,体重、泌乳量相近的萨能奶山羊作为瘤胃上皮供体。采用3×3双因素试验设计,山羊屠宰后采集瘤胃上皮,插入到尤斯灌流仪器(Ussing chamber)半室中央,在浆膜侧半室加入5 m L缓冲液,黏膜侧加入配制好的不同处理的培养液5 m L,每个处理3个重复。试验1:因素1为p H,分别为7.4、5.5、5.2;因素2为LPS浓度,分别为0、30、60 k EU/m L。试验2:因素1为p H,分别为7.4、5.5、5.2;因素2为HIS浓度,分别为0、0.5、10.0 ng/m L。采集培养80 min后的瘤胃上皮,测定其紧密连接蛋白Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7、Occludin、zonula occludens-1(ZO-1)mRNA表达量。结果显示:1)p H与LPS的交互作用对Claudin-1、Claudin-7、ZO-1 mRNA表达量影响显著(P0.05)。p H 7.4×10.0 ng/m L HIS组Claudin-7 mRNA表达量显著低于p H 7.4×0 ng/m L HIS组(P0.05)。与p H 7.4×0 ng/m L HIS组相比,降低p H或添加LPS有提高ZO-1 mRNA表达量的趋势,且p H 5.2×10.0 ng/m L HIS组显著提高(P<0.05)。结果提示,亚急性瘤胃酸中毒(SARA)发生后,p H与LPS或HIS交互作用于瘤胃上皮,降低瘤胃上皮紧密连接蛋白mRNA表达量,进而增大瘤胃上皮黏膜通透性。

摘要：为建立基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究采用慢病毒转导构建稳定表达Cas9蛋白的BHK-21-Cas9单克隆细胞系。将pMD2.G、pSPAX2和lentiCas9-Blast共转染HEK-293T细胞包装慢病毒,感染BHK-21细胞后经Blasticidin S进行阳性筛选,筛选5代后通过有限稀释法培养Cas9单克隆细胞,利用Western blot检测Cas9蛋白的表达。为获得Cas9活性强的BHK-21-Cas9单克隆细胞系,根据紧密连接蛋白(OCLN)基因序列,设计针对OCLN基因的sgRNAs,构建lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重组质粒,测序鉴定后将lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重组载体转染BHK-21-Cas9单克隆细胞系。使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,经过Western blot检测OCLN蛋白的表达。Western blot检测Cas9蛋白结果显示,共获得了17株BHK-21-Cas9单克隆细胞系;测序结果显示,lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA载体构建成功,通过Western blot鉴定,有2株Cas9编辑效果好、具有高敲除效率的BHK-21单克隆细胞系。结果表明,本研究构建了稳定表达Cas9蛋白的BHK-21-Cas9单克隆细胞系,可以用于CRISPR/Cas9敲除文库的转导,建立基因敲除细胞文库,为筛选影响病毒感染和复制的功能基因提供了科学依据。

摘要：目的 探讨短链脂肪酸（SCFA）对内毒素/脂多糖（LPS）引起的人肠上皮细胞屏障功能损害的作用及相关机制。方法 建立人肠上皮细胞株Caco-2单层细胞培养模型。取细胞按随机数字表法分为对照组、LPS组及SCFA＋LPS组。对照组细胞仅采用DMEM培养液常规培养，LPS组细胞在DMEM培养液中另加入终质量浓度为10 μg/mL的LPS，SCFA＋LPS组细胞在DMEM培养液中另加入终质量浓度为10 μg/mL的LPS和SCFA（由0.5 mmol/L乙酸、0.01 mmol/L丙酸、0.01 mmol/L丁酸组成）的混合液培养。于培养0、1、2、6、12、24 h，取细胞采用电阻测定仪测定细胞的跨上皮电阻（TER），样本数为72。另取细胞同前分组及处理后，采用蛋白质印迹法于培养24 h后检测带状闭合蛋白1（ZO-1）、咬合蛋白及闭合蛋白1表达，样本数为6。另取细胞同前分组及处理后，采用免疫荧光法检测细胞形态及ZO-1的分布。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验及Bonferroni校正。结果 （1）与对照组相比，LPS组细胞培养1-24 h的TER均明显降低（P〈0.01），SCFA＋LPS组细胞培养1-24 h的TER无明显变化（P〉0.05）。SCFA＋LPS组细胞培养1-24 h的TER均较LPS组明显升高（P〈0.01）。（2）与对照组的1.25±0.10、1.17±0.04、1.24±0.20相比，LPS组细胞培养24 h ZO-1、咬合蛋白及闭合蛋白1的表达量（0.74±0.23、0.76±0.11、0.77±0.11）均明显降低（P〈0.05），而SCFA＋LPS组细胞培养24 h ZO-1、咬合蛋白及闭合蛋白1的表达量（1.23±0.46、1.05±0.09、1.01±0.13）均与之相近（P〉0.05）。与LPS组相比，SCFA＋LPS组细胞培养24 h的咬合蛋白和闭合蛋白1表达量均明显增加（P〈0.05），ZO-1表达量增加但差异无统计学意义（P〉0.05）。（3）培养24 h对照组细胞排列紧密，近似鹅卵石样外观；ZO-1沿细胞膜呈连续、规则排列。LPS组细胞排列稀疏且形态改变；ZO-1沿细胞膜不规则排列，且偶有断裂和卷曲。SCFA＋LPS组细胞形态和ZO-1排列均较LPS组明显改善。结论 SCFA可通过阻断LPS引起的TER下降、紧密连接蛋白表达下降和ZO-1分布异常，从而减轻LPS对人肠上皮细胞屏障的损害。

摘要：猪流行性腹泻病毒(PEDV)可通过感染猪肠道上皮细胞引起仔猪腹泻。紧密连接蛋白是肠道黏膜屏障的重要组成部分,而Claudin家族作为重要的紧密连接蛋白之一,是组成肠道黏膜屏障完整性、决定肠道通透性的重要蛋白分子。研究密码子的使用特性有助于进一步了解某一特定基因的分子机制和进化关系。为了揭示Claudin家族基因密码子使用模式,本研究对Claudin家族22个基因编码序列进行分析,利用CodonW和在线网站EMBOSS Explore计算核苷酸组成、相对同义密码子使用度(RSCU)和密码子使用偏性参数,同时分析了Claudin家族基因密码子使用偏好性的影响因素。结果表明:Claudin家族基因主要偏好以G/C结尾的密码子; RSCU值分析发现,11个密码子CUG、AUC、GUG、UCC、CCC、ACC、GCC、CAG、CGC、CGG、GGC偏好性较强,为优势密码子;聚类结果显示,Claudin-3和Claudin-4较为接近,Claudin-10和Claudin-11较为接近;此外,Claudin家族基因密码子偏好性主要受到突变压力影响。分析Claudin家族基因密码子使用模式,旨在揭示这些基因之间的遗传和进化关系,为今后从密码子优化途径提高外源基因的表达水平提供一定的理论依据。

摘要：本研究旨在探讨过瘤胃谷氨酰胺对饲喂高精料的奶山羊瘤胃上皮屏障的保护效应。实验采用随机区组设计,将12头健康奶山羊随机分为高精料组(n=6)和高精料添加谷氨酰胺组(n=6),谷氨酰胺添加量为50g/(d·头)。谷氨酰胺处理4周后,每组各选取4头山羊进行屠宰。HE染色、扫描和透射电镜法观察瘤胃上皮的组织形态学变化,实时荧光定量PCR法检测瘤胃上皮炎症因子及紧密连接蛋白mRNA的相对表达水平。结果表明,与对照组相比,添加谷氨酰胺显著降低了瘤胃液中丙酸浓度(P0.05);对组织形态的观察结果表明,添加过瘤胃谷氨酰胺可维持瘤胃复层扁平上皮各细胞层的完整性,保护角质层,减少细胞凋亡;并显著降低瘤胃上皮组织中TNF-α的mRNA相对表达量(P0.05)。结果说明,高精料日粮下添加过瘤胃谷氨酰胺可降低瘤胃上皮的炎症反应,改善上皮紧密连接,从而维护瘤胃上皮屏障的正常功能。

摘要：目的研究华蟾素对溃疡性结肠炎(UC)大鼠的作用及其机制。方法用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)结肠灌注建立UC大鼠模型。按照大鼠体重随机分为对照组、模型组、阳性对照组、华蟾素低剂量组(HCS-L)、华蟾素高剂量组(HCS-H),每组6只。对照组、模型组予以生理盐水灌肠,阳性对照组给予美沙拉嗪灌肠液1.5 g·kg^(-1)灌肠,HCS-L、HCS-H分别予以华蟾素200、400 mg·kg^(-1)灌肠,每日1次,连续14 d。用疾病活动指数(DAI)、结肠黏膜损伤指数(CMDI)进行评分,用苏木素-伊红(HE)染色观察结肠病理变化,用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清中炎性因子水平,用免疫组化法检测结肠组织中NOD样受体蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶-1(caspase-1)、咬合蛋白(Occludin)、带状闭合蛋白(ZO-1)的表达情况。结果对照组、模型组、阳性对照组、HCS-L、HCS-H的DAI评分分别为0.11±0.27,2.44±0.54,1.22±0.78,1.33±0.73,1.06±0.61;上述5组的CMDI评分分别为0.17±0.41,2.83±1.17,1.00±0.89,1.33±0.52,0.83±0.75;与正常组比较,模型组DAI评分、CMDI评分均显著升高,与模型组比较,阳性对照组、HCS-L、HCS-H的DAI评分、CMDI评分均显著降低(均P<0.05)。与正常组比较,模型组血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)均显著升高,与模型组比较,阳性对照组、HCS-L、HCS-H血清中IL-1β、IL-18、TNF-α均显著降低(均P<0.01);与正常组比较,模型组结肠组织中NLRP3、caspase-1的平均光密度值均显著升高,Occludin、ZO-1的平均光密度值均显著降低(均P<0.01),与模型组比较,阳性对照组、HCS-L、HCS-H结肠组织中NLRP3、casepase-1的平均光密度值均显著降低,Occludin、ZO-1的平均光密度值均显著升高(均P<0.01)。结论华蟾素可明显缓解UC大鼠症状,改善UC大鼠肠黏膜病变,其机制可能与抑制NLRP3的过度激活、降低炎症反应、增强黏膜屏障的完整性有关。