摘要：纳米抗体是天然存在的最小的免疫球蛋白功能片段,具有高亲和力、高稳定性和可溶性、高组织渗透性、低免疫原性、低生产成本且能结合多种表位等优势。纳米抗体不仅在基础科学研究中发挥重要作用,而且在疾病的预防、诊断和治疗方面有着广阔的应用前景。本文从纳米抗体的简介、制备方法、优势和应用四个方面进行阐述,为中学师生全面了解抗体的类型和应用以及生物学教学中相关内容的课堂设计提供参考资料。

摘要：基于纳米抗体(nanobody,Nb)的免疫磁珠,因其独特的性能在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化等领域受到广泛关注。但目前国内外缺乏对基于Nb与生物源性磁颗粒(bacterial magnetic particles,BMPs)和化学合成的磁颗粒(magnetic particles,MPs)构建的免疫磁珠性能差异的研究。本研究以3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid,3-PBA)Nb作为研究对象,通过基因工程技术在其C-端引入半胱氨酸(cysteine,Cys),获得Nb-6His-Cys重组蛋白质。利用双功能交联试剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate,SPDP)将Nb-6His-Cys分别与BMPs和MPs进行偶联获得免疫磁珠,评价2种免疫磁珠的性能差异。结果表明,SPDP能够分别将Nb-6His-Cys定向固定在BMPs和MPs表面上;磁珠表征发现,BMP-Nb的水合粒径、电位和分散性均优于MP-Nb(BMP-Nb的水合粒径为68.43±24.54,电位-27.89 mV,分散性0.57;MP-Nb的水合粒径为27.31±5.28,电位-26.12 mV,分散性0.44);通过差值法计算发现,BMPs可展示更多的Nb-Cys(1 mg的BMPs上能够展示697±16μg 3-PBA Nb-Cys,1 mg的MPs上能够展示569±18μg 3-PBA Nb-Cys)。综上研究表明,Nb和BMPs构建的免疫磁珠性能优于Nb和MPs构建的免疫磁珠,本实验为合理选择免疫磁珠检测方法提供了理论依据,为实现3-PBA的环境快速检测提供物质支撑。

摘要：【目的】建立抗犬细小病毒(CPV)纳米抗体(Nb)库,从中筛选出具有中和活性的Nb。【方法】以高免比格犬脾脏组织cDNA进行重链可变区(VH)扩增,与pBSD载体连接,构建pBSD-Nb库。结合细菌展示、流式细胞仪检测,在pBSD-Nb库中筛选高亲和力的Nb,获得阳性克隆并测序。利用Primer Premier 5.0软件设计Nb基因的上、下游引物,将阳性克隆质粒中Nb基因片段进行PCR扩增。利用pET-27b表达目的蛋白,通过变性、复性手段纯化目的蛋白,用SDS-PAGE分析纯化后的蛋白。将Nb包被96孔板,采用ELISA法检测Nb对CPV的亲和力。通过病毒微量中和试验检测Nb抑制CPV感染猫肾细胞(F81)的情况。【结果】PCR扩增结果显示,在384 bp处可见明显条带,与预期大小相符,证明pBSD-Nb库构建成功。细菌展示后,流式细胞术检测结果显示,有9株阳性峰偏移率高的Nb,分别命名为Nb1、Nb2、Nb3、Nb4、Nb5、Nb6、Nb7、Nb8和Nb9。PCR扩增9株Nb基因片段,获得384 bp的条带。SDS-PAGE结果显示,在约14 ku处有一条带,说明成功获得纯化蛋白。ELISA检测结果表明,9株Nb中有6株Nb对CPV的亲和力较强。体外病毒中和试验检测发现,1株Nb能够中和病毒,抑制F81细胞病变,中和病毒的有效浓度为0.05 mg/mL。【结论】本研究成功建立pBSD-Nb库,筛选出6株对CPV具有高亲和力的Nb,并成功获得1株具有中和活性的Nb,为CPV治疗性抗体制剂的开发提供了新的思路。

摘要：【目的】获得抗信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)蛋白的特异性纳米抗体,通过验证该纳米抗体在免疫组织化学和Western blotting检测中的应用及对黑色素瘤细胞B16生长的作用,对其功能进行鉴定。【方法】通过噬菌体展示淘筛技术从羊驼B16纳米抗体文库中筛选抗STAT3纳米抗体,获得阳性克隆并测序;根据序列信息设计和构建pColdⅠ原核表达质粒,并通过大肠杆菌进行纳米抗体表达;通过镍柱、分子筛和超滤管进行纯化和浓缩;利用免疫组织化学和Western blotting验证纳米抗体是否结合脑组织中STAT3蛋白;采用CCK8法分析该纳米抗体对B16细胞增殖的影响,并用Western blotting检测其对其分子路径相关基因表达的影响。【结果】经过噬菌体展示淘筛及阳性克隆测序后,成功获得1株特异性结合STAT3蛋白的纳米抗体单克隆菌株,命名为STAT3-VHH-10B;将构建的该纳米抗体的pColdⅠ原核表达载体进行诱导表达和纯化,SDS-PAGE结果显示,成功得到大小约为15 ku的抗STAT3纳米抗体;免疫组织化学和Western blotting结果显示,纯化制备的纳米抗体可成功检测到大脑组织中STAT3的表达;细胞增殖检测结果显示,该纳米抗体对B16细胞增殖具有明显的抑制作用,并下调细胞增殖路径的主要基因CycD 1、Bcl2、cMyc编码蛋白的表达。【结论】本研究成功筛选到1株抗STAT3蛋白的特异性纳米抗体,且该纳米抗体可用于免疫组织化学和Western blotting法检测组织中STAT3的表达,此外,通过与抗原结合后,抑制主要基因CycD 1、Bcl 2、cMyc的表达,从而抑制B16细胞增殖。本研究结果将为STAT3及其纳米抗体的功能研究提供新工具。

摘要：羊驼体内存在天然缺失轻链的重链抗体(HcAb),其单域抗原结合片段也称为VHH或纳米抗体(nanobody,Nb),是目前已知的最小抗原结合片段。与传统抗体相比,纳米抗体具有分子量小(12~15kDa)、稳定性好和免疫原性低等特点,这些特点使得VHH在基础研究、诊断及治疗上具有极大的应用价值,目前已有多种纳米抗体进入了临床研究阶段。综述了近年来VHH在革兰氏阴性菌(大肠杆菌)、革兰氏阳性菌(芽孢杆菌和乳酸杆菌)、酵母、丝状真菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞中异源表达的研究现状,包括表达系统、宿主、载体特点、载体构建方式及产量等;从分子水平、表达水平和理性设计三个层面探讨了纳米抗体产量提高的策略,以期为纳米抗体研究者提供借鉴和思路。

摘要：目的在哺乳动物细胞内基于线性双链DNA"与门"基因线路构建纳米抗体文库。方法应用基于线性双链DNA的"与门"逻辑基因线路构建纳米抗体文库,首先通过PCR扩增将互补决定区(CDR)随机序列引入上、下游线性双链DNA,将其共转染至HEK293T细胞,转染48 h后,经RNA提取、cDNA合成、PCR扩增、高通量测序和数据处理步骤,鉴定"与门"形成的纳米抗体文库序列,对本策略进行了分析与评价。结果深度测序共测得4 173 356条序列,其中约88.18%的序列为纳米抗体文库序列。文库核酸序列最丰富的序列长度为264 bp,为理论设计长度。后续在264 bp序列中鉴定出22 172种纳米抗体序列,且CDR1~3序列中的核苷酸频率符合NNK模式。结论本研究开发了一种基于线性双链DNA"与门"逻辑基因线路在哺乳动物细胞中构建纳米抗体文库的新方法。

摘要：纳米抗体(nanobodies,Nbs)具有较小的相对分子质量,其独特的分子结构使其适用于疾病诊断治疗等诸多领域,由于其缺少Fc段,不能引发普通单抗药物在肿瘤治疗中重要的细胞毒作用,在肿瘤治疗领域的前景一度不被看好,但随着药物研究的不断深入及更合理的设计,Nbs在该领域的应用正在不断扩展。目前研发中的Nbs是以直接拮抗作用、与效应分子相连、与药物递送系统相连等多种形式参与肿瘤治疗,并可联合应用于靶向性放射核素疗法及光动力疗法中。本文就Nbs的成药特性、Nbs在肿瘤治疗中的应用及目前处于临床试验阶段Nbs药物的研究现状作一综述。

摘要：针对细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)和CXC趋化因子受体4型(CXCR4)两个靶点,设计anti-PD-L1&CXCR4双特异性纳米抗体的基因序列,C末端连接组氨酸标签(6×His标签),通过pET-22b(+)重组表达质粒转化大肠埃希菌*** BL21,经IPTG诱导表达,以可溶性形式存在于菌体裂解上清液。为了提高双特异性纳米抗体的产量和纯度,采用3种不同的方法进行样品制备和纯化。结果表明,通过机械裂菌并改进缓冲液的盐离子和咪唑浓度以及pH,经His Trap FF亲和色谱柱纯化后,对双特异性纳米抗体分离效果较好,目的蛋白产量超过1 mg/L,纯度可达到97%。同时,anti-PD-L1&CXCR4双特异性纳米抗体能够与细胞表面两个抗原特异性结合,增强IL-2活化的人外周血单个核细胞(PBMC)对胰腺癌细胞株AsPC-1的杀伤能力,为其后续体内药效学评价奠定了基础。

摘要：通过分选酶和谷氨酰胺转氨酶催化反应制备了一种由纳米抗体和绿色荧光蛋白sfGFP组成的靶向成像探针.通过设计一类具有两种酶识别结构的树枝状聚氨基酸底物来制备偶联了纳米抗体和sfGFP的蛋白簇.该靶向蛋白簇能够特异性结合靶细胞并呈现绿色荧光信号.在肿瘤异种移植的小鼠模型中,该靶向蛋白簇能够快速富集到肿瘤部位,并在9h内逐渐被代谢排出.

摘要：纳米抗体作为一种小分子抗体,与传统抗体以及衍生出的单链抗体(Sc Fv)相比,具有高亲和力、高特异性以及高稳定性等特点。同时它还具有传统抗体不具备的优势,分子质量小,体内组织渗透性好,极易穿过血管或组织到达靶部位,这些优势使得纳米抗体被广泛的用于疾病诊断与检测的工具。迄今为止,已有多种多价的纳米抗体进入各期临床研究,应用于癌症、自身免疫病、呼吸系统、血液系统等疾病。并随着研究的不断深入会有更多的纳米抗体应用于临床,但是多价的纳米抗体如果长期用于临床可能会产生不同程度的免疫反应,影响治疗效果,因此,纳米抗体进行人源化越来越被关注。该文介绍几种纳米抗体人源化策略及表达系统。