摘要：背景:组织工程骨的应用是一种新兴的解决骨缺损的先进手段,但是由于受到植入体无营养代谢的限制,难以大量应用于临床。组织工程骨预血管化研究就是针对这一局限性,进行人工植入体的前瞻性和程序性的血管构建,以期解决植入体的营养代谢问题,国内外学者已取得大量研究成果。目的:对组织工程骨体外预血管化实验研究成果和发展趋势进行多层次分析探讨。方法:检索 CNKI 数据库和 Pubmed 数据库 2000 至 2012 年文献,中文检索词:组织工程骨,血管化,植入支架,成骨细胞,血管内皮细胞,共培养,英文检索词:bone engineering, endothelial cells, osteoblast, implant,cells co-culture。按照基础骨生理研究、体外细胞实验研究和材料学研究进行分类,完成组织工程骨体外预血管化研究的综述。结果与结论:共纳入 60 篇文献进行分析。此次检索的文献证明,在正常骨组织中,微血管的发生对成骨具有重要的调控作用,目前组织工程骨研究正在模拟人体内血管再生这一生理过程,设计完成了大量体外预血管化的实验,证实了血管预成型的应用有利于组织工程骨的体内存活和骨化,为组织工程骨临床应用指明了发展方向。

摘要：背景:异种脱蛋白松质骨来源广泛且具有独特的生物学特性,若能解决其免疫原问题,将有望利用异种脱蛋白松质骨开发出一种新型植骨材料。目的:探讨异种脱蛋白松质骨作为骨组织工程支架的性能,及其在山羊脊柱横突间融合中的作用。设计、时间及地点:细胞-支架学体内实验,于2008-02/10在黑龙江省纤维化生物治疗重点实验室完成。材料:6～8月龄健康雄性山羊12只,由牡丹江医学院动物中心提供。方法:取成年猪股骨远端松质部分,通过理化方法制成脱蛋白松质骨支架,对其形态结构、组成成分、生物力学特性以及材料对种子细胞生物学行为的影响进行检测分析。羊髂骨穿刺取骨髓,梯度密度离心法分离获得第3代骨髓间充质干细胞。将支架材料复合一定量的自体骨髓间充质干细胞、重组人骨形成蛋白2构建组织工程骨。12只羊建立L3、4双侧横突间植骨模型,修复组于左侧植入组织工程骨,对照组于右侧植入相同体积的自体髂骨。主要观察指标:分别于植入后4,8,12周行X射线片和组织学观察对比分析。结果:采用脱蛋白处理后的松质骨可见大小不等、相互交通、开放孔隙的网架结构,孔径200～500μm,孔隙率60%左右,其无机成分为羟基磷灰石,有机成分为胶原,力学性能保存良好,细胞相容性良好。X射线片结果显示:植入第4周,横突桥接处部分区域模糊,以内侧明显,此时修复组材料密度略低于对照组;第8周上下桥接部间隙变小,大量连续骨痂生成;12周后完全融合,两组材料密度接近。移植区组织学观察结果显示:修复组植入后第4周以多点方式形成新骨,第8周岛状生成的骨组织贯穿整个移植材料,12周编织骨交错排列,髓腔形成,成骨活性接近自体髂骨移植;对照组植入后4周有较多新骨形成,8周时出现大量胶原纤维,周边成骨明显,至12周纤维组织减少,成骨活跃。结论:以异种脱蛋白松质骨为支架材料,复合骨髓间充质干细胞、重组人骨形成蛋白2构建组织工程骨,体外X射线衍射分析及力学测试与体内成骨实验均证明其具有良好的组织相容性和较强的成骨能力,是一种良好的组织工程骨支架材料。

摘要：目的: 提出一种基于计算机辅助设计 (CAD) 和快速成型技术 (RP) 的大块组织工程骨支架结构设计、制造方法, 观察人成骨细胞与支架的相容性及细胞生长情况。方法:应用CAD软件设计生成支架负型CAD模型, 快速成型技术制备树脂模具, 在模具中填充β- 磷酸三钙 (β- TCP), 高温烧结后制成支架。将人成骨细胞与支架复合培养, 扫描电镜 (SEM) 观察细胞生长情况。结果: 支架负型CAD模型为内部呈轮辐形网架结构的圆柱体, 制得树脂模具及支架与设计模型一致。SEM观察: 细胞增殖分化良好, 大量细胞生长入管状孔道内。结论: 该方法实现大块组织工程骨支架结构的精确设计和可控制造, 制得支架与人成骨细胞有良好的生物相容性, 内部结构利于细胞长入支架深部。

摘要：目的:设计、制造一种新的灌注式生物反应器,专门用于高效地构建大体积、β-磷酸三钙组织工程骨。方法:在普通模式灌注生物反应器的灌流室内生成间断性低压环境(-0.01 mpa,0.5 Hz),用材料色素颗粒洗脱实验进行验证后,将复合兔骨髓间充质干细胞的大段、管状β-磷酸三钙材料分别在静态、反应器内常压灌注和间断低压灌注三种环境下培养4周。期间收集培养液检测葡萄糖日耗量、细胞活力(MTT比色法)、碱性磷酸酶比活性、骨桥蛋白水平,并进行硬组织切片检查。结果:色素颗粒洗脱实验证明,间断性低压可以改善低流量液流在材料内的分布;在培养2周和4周时,负压灌注组日均葡萄糖消耗量和细胞活力均显著高于常压灌注组:(t=20.254 P<0.05,t=64.794 P<0.05)及(t=17.586 P<0.05,t=7.583 P<0.05);碱性磷酸酶(ALP)比活性测定和骨桥蛋白水平(OPN)反映间断低压灌注组中骨髓间充质细胞向成骨细胞分化效率更高,但高峰相晚于常压灌注组和静态培养组;在间断低压灌注组中材料深部的占孔率最高,并且分布更均匀。结论:此新型灌注式生物反应器适用于构建大体积、特殊构型组织工程骨;其高效的促进细胞增殖效应可减少初始复合的种子细胞数量,缩短构建周期。

摘要：背景:骨衍生材料中冻干骨异抗原去除不充分,免疫原性强烈;脱蛋白骨和完全脱钙骨基质抗原性较弱,但前者无成骨诱导能力,后者生物力学性能很差,临床应用受到限制。目的:观察以部分脱钙冻干骨材料为支架的组织工程骨移植后兔外周血T细胞亚群的变化及移植组织的组织学变化。设计、时间及地点:随机分组设计、动物对照观察,于2006-06/2007-06在四川大学华西医院,生物治疗国家重点实验室与干细胞与组织工程研究室完成。材料:组织工程骨以兔骨膜来源的成骨细胞为种子细胞,经抗原自消化、部分脱钙、冻干后的异体骨为支架材料于体外构建。方法:将48只兔按随机数字表法分为4组,每组12只。分别用部分脱钙冻干骨、组织工程骨、自体骨、同种异体骨植入兔桡骨1cm节段性缺损处。主要观察指标:流式细胞仪检测4组植入前及植入后1,2,4周移植早期外周血T淋巴细胞亚群变化,并通过组织学检测观察植入后2,4,8,12周时4种材料的成骨作用。结果:①部分脱钙冻干骨组、组织工程骨组植入后1,2周外周血CD4+和CD8+T细胞较植入前明显升高(P0.05)。自体骨组植入后CD4+和CD8+T细胞升高不明显(P>0.05)。同种异体骨组植入后1,2,4周外周血CD4+和CD8+T细胞较植入前及其他各组同期均明显增高(P<0.05)。②组织工程骨组植入后2周与材料孔隙内有成骨细胞和成软骨细胞,可见骨及软骨混合性新生物形成,周边分布有破骨细胞,部分网架呈蚕食状被破坏吸收。植入后4周,形成的新生骨过渡为编织骨。植入后8周,形成板层骨,部分脱钙冻干骨支架材料已被完全降解﹑吸收。植入后12周,植入物均已完全被板层样骨所替代,髓腔再通。结论:部分脱钙冻干骨为支架材料构建的细胞-材料复合体移植后外周血T淋巴细胞增高,但不影响其良好的修复骨缺损能力。

摘要：背景:富血小板血浆中的多种生长因子及带血管筋膜是否具有促进骨再生及血管化作用尚在争论之中。目的:拟从组织影像学角度评价富血小板血浆及带血管筋膜对骨髓基质干细胞/脱钙骨基质复合的组织工程骨血管化作用效果。设计、时间及地点:单一样本观察及动物同体对照实验,于2004-10/2007-11在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。材料:11～12月龄健康杂种犬12只,体质量20～25kg,雌雄各半。方法:①采用密度梯度离心法从犬骨髓中分离骨髓基质干细胞,体外贴壁培养扩增、成骨诱导培养。取杂种犬的股骨制备脱钙骨基质,并与骨髓基质干细胞复合。②将每只犬的背部分为4个区,A,B区,植入加富血小板血浆的骨髓基质干细胞/脱钙骨基质复合体,C,D区,仅植入骨髓基质干细胞/脱钙骨基质复合体。A,C区植入物用背阔肌带血管肌筋膜包裹;B,D区植入物用背部不带血管的浅筋膜包裹。分别在4,8,12周各取4只,雌雄各半,麻醉后处死取标本。主要观察指标:①采用倒置相差显微镜观察骨髓基质干细胞形态,四甲基偶氮唑盐法测定细胞生长曲线。②行改良钙钴法碱性磷酸酶染色,VonKossa法、茜素红法,钙结节染色观察诱导成骨细胞形态特征。③应用倒置相差显微镜、扫描电镜观察复合体的结构。④行大体标本、X射线数字影像及组织学观察评价。结果:①诱导成骨分化的骨髓基质干细胞分泌的碱性磷酸酶及钙结节染色均呈阳性。②骨髓基质干细胞和成骨诱导细胞的生长曲线呈典型的S形。③同种异体脱钙骨基质与骨髓基质干细胞复合培养后,细胞上架率高,生长状态好,增殖迅速,能分泌大量细胞外基质。④各时间点A,B,C区在成骨的骨量、骨光学密度、血管化程度等方面均明显优于D组(P<0.05)。结论:经组织影像学观察证实,富血小板血浆和带血管肌筋膜均能促进组织工程骨的成骨和血管化,且两者具有协同作用。

摘要：背景:组织工程骨的血管化是构建过程中的关键环节。目的:动态观察带蒂筋膜瓣包裹组织工程骨的血管化过程,以及其修复大段骨缺损的一般规律。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-10/2006-04在南方医科大学南方医院创伤骨科实验室完成。材料:6月龄健康新西兰大白兔12只双侧髂骨抽取骨髓分离骨髓基质干细胞诱导分化成骨细胞。圆柱状(3×15)mm多孔β-磷酸三钙为法国贝奥路公司产品。方法:将成骨细胞与β-磷酸三钙复合培养7d后细胞量达到1×109L-1为组织工程骨,实验组兔左侧前肢内侧剥离带蒂筋膜瓣(2×1.5)cm包裹圆柱状组织工程骨植入1.5cm桡骨缺损处,对照组于同一只兔右侧桡骨1.5cm骨缺损处植入未包裹组织工程骨。主要观察指标:植入后2,4,6,8,12周进行大体观察、组织学、放射学、骨密度和放射性核素骨显像检测。结果:①从第4周以后各时间点实验组修复效果均优于对照组,X射线相对阻射值定量分析实验组的评分高于对照组(P<0.05),骨密度值高于对照组(P<0.05),放射性强度高于对照组(P<0.05)。②从第4周以后各个观察点实验组在血管化程度、新骨形成量、材料降解速度、骨缺损修复时间、骨修复改建质量都优于对照组。结论:采用蒂筋膜瓣包裹组织工程骨修复骨缺损,4周后,在血管化程度、新骨形成量、材料降解速度及骨缺损修复时间方面均优于无筋膜包裹的组织工程骨,提示早期的快速血管化直接影响到骨缺损修复的全过程。

摘要：背景:随着骨组织工程学研究的深入,细胞因子对干细胞向成骨细胞转化和对骨愈合的影响越来越受到重视。目的:观察骨形态发生蛋白(bone morphogenic protein,BMP)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)复合骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymal stem cells,MSCs)和纳米晶胶原基骨(nano-Hydroxyapatite/collagen,nHAC)复合物修复大鼠股骨骨缺损的效果。设计、时间及地点:完全随机分组设计,对比观察实验,于2007-12/2008-08在江苏大学临床医学院实验室完成。材料:将培养的第3代大鼠MSCs密度调整为5×109L-1,接种到nHAC材料表面,制成MSCs/nHAC复合支架。取复合培养的支架分别与BMP混悬液、聚乙烯吡咯烷酮、VEGF溶液混匀,负压下真空抽吸,冻干24h备用(每鼠所植入支架含BMP15mg,VEGF0.8μg)。方法:将30只SD大鼠按照随机数字表法分3组制成股骨缺损模型:单纯nHAC组骨缺损处单纯植入nHAC;MSCs/nHAC组植入MSCs/nHAC复合物;VEGF/BMP/MSCs/nHAC组植入VEGF/BMP/MSCs/nHAC复合物。主要观察指标:术后2,4,8,12周行影像学和组织学观察;术后12周行环境扫描电镜观察。结果:①各时间点动物均未出现排斥及炎症反应,创口愈合良好。②术后各时间点VEGF/BMP/MSCs/nHAC组放射学评分高于与其余2组(P<0.05)。③组织学检查结果显示MSCs/nHAC组、VEGF/BMP/MSCs/nHAC组较单纯nHAC组能更快的促进大鼠股骨缺损处骨再生;VEGF/BMP/MSCs/nHAC组的促进作用更明显。④术后12周扫描电镜观察单纯nHAC组骨纤维排列不规则,可见大量骨陷窝;MSCs/nHAC组可见大量成骨细胞,中量骨小梁结构,但仍可见间隙;VEGF/BMP/MSCs/nHAC组可见哈佛系统,大量骨小梁排列规则。结论:VEGF/BMP/MSCs/nHAC复合物较单纯nHAC或MSCs/nHAC复合物有更好的成骨能力。

摘要：背景:纳米晶羟基磷灰石胶原基骨修复材料具有与天然骨成分接近,结构和形貌图谱分析与天然骨相似,生物相容性好等特点,且材料多孔,孔径较大、孔隙率及孔隙交通率高,符合作为骨组织工程支架材料的要求。目的:观察兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养的结合程度。设计、时间及地点:体外观察实验,于2006-03/09在江苏大学医学院细胞实验室完成。材料:健康雄性新西兰大白兔1只,1月龄。纳米晶胶原基骨修复材料由清华大学材料系提供。方法:体外分离培养、纯化兔骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养。主要观察指标:①兔骨髓间充质干细胞生长形态及生长曲线。②复合培养5,10d后扫描电镜观察二者复合程度。③复合培养5,10d时纳米晶胶原基骨修复材料上结合的细胞数量。结果:兔骨髓间充质干细胞贴壁生长,增殖速度快,生长曲线符合Logistic生长曲线,兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养,在第5,10天进行扫描电镜观察,发现10d时黏附于纳米晶胶原基骨上的骨髓间充质干细胞数明显高于5d时黏附的细胞数,差异有显著性意义(P<0.01)。结论:兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养结合程度较高。

摘要：背景:生物衍生支架材料具备与自身骨相似的结构和微环境,具有较好的应用前景。目的:探讨生物衍生骨复合成骨诱导的骨髓间充质干细胞修复兔桡骨的节段性骨缺损的可行性,并与单纯生物衍生骨进行比较。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-01/2008-01在南华大学生命科学院实验室完成。材料:同种异体骨经脱脂、脱蛋白、部分脱钙和冻干等方法处理后制备生物衍生骨支架材料,与自体骨髓间充质干细胞复合制备组织工程骨支架材料。方法:25只健康成年新西兰大白兔双侧桡骨制备中段15mm的骨缺损,随机取其中20只兔右侧桡骨为实验组植入组织工程骨,左侧为对照组植入单纯生物衍生骨,不做内外固定;另5只兔双侧骨缺损处不植入任何材料作为空白组。主要观察指标:应用X射线放射学检查及组织学观察比较3组骨缺损修复的能力。结果:X射线显示随时间延长骨折处骨痂逐渐增多,实验组8周基本愈合,12周塑形完成;对照组骨痂少,愈合时间推迟;空白组术后12周骨缺损未见骨性修复,最后形成骨不连。术后2,4,8,12周实验组放射学检查评价新骨生成优于对照组(P<0.05)。组织学检查显示实验组术后4周时材料开始吸收,8周基本降解吸收被新生骨取代,12周完全修复;对照组明显推迟,新骨生成速度、生成量低于实验组(P<0.05);空白组各时点均无新骨形成,最后缺损由纤维组织充填。结论:成骨诱导的间充质干细胞/生物衍生骨复合构建组织工程化骨植入修复兔桡骨缺损能够加速新骨形成,其修复能力明显优于单纯生物衍生骨。