摘要：根据文库载体序列与原组织蛋白酶表达序列标签(EST)设计引物,以大片吸虫cDNA文库为模板,进行Touchdown PCR与梯度PCR相结合的扩增反应,扩增产物克隆入pMD18-T载体,经鉴定后测序,并采用生物信息学技术对序列进行开放阅读框(ORF)、编码氨基酸序列、蛋白质同源性比较、二级、三级结构等分析;结果所获序列全长990 bp,编码330个氨基酸,分子量36771.2 u,等电点5.44;具有较明显的螺旋、片层和无规卷曲等二级结构,α螺旋占17.3%,β折叠占27.0%,无规卷曲占55.8%;具有2个较明显的跨膜区和2个疏水区,未发现明显的信号肽和糖基化位点;氨基酸序列同源性比对显示其属于半胱氨酸家族;三级结构同源建模预测显示其与组织蛋白酶K(PDB number 2f7dA)有49%的一致性。

摘要：【目的】克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的组织蛋白酶l(cathepsin l,Catl)基因,分析该基因的序列特征并制备该酶多克隆抗体,为探析其生理功能奠定基础。【方法】根据甜菜夜蛾Spodoptera exigua的组织蛋白酶l基因开放阅读框(ORF)序列两端直接设计引物克隆草地贪夜蛾组织蛋白酶l基因。利用生物信息学软件分析该基因的序列特征,利用ClustalX2软件进行同源比对和进化分析,利用同源建模预测该酶三维结构。通过原核表达重组蛋白,多次免疫新西兰大白兔制备该酶多克隆抗体。【结果】克隆获得了草地贪夜蛾的组织蛋白酶l基因SfCatl(GenBank登录号:HQ110065),ORF序列长1 035 bp,编码344个氨基酸,预测N-末端含有长度为16个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为36.8 kD,等电点为6.69。SfCatl氨基酸序列与其他13个物种的组织蛋白酶l氨基酸序列比较有53.7%~96.8%的一致性,与甜菜夜蛾组织蛋白酶l氨基酸序列一致性最高,达96.8%。同源建模预测表明,SfCatl折叠成紧密而稳定的元宝状结构,含3个对结构有稳定作用的二硫键,亲水性氨基酸主要包被在蛋白的表面。原核表达、纯化SfCatl蛋白制备抗血清,其效价超过1∶40 000,Western blot鉴定结果表明抗血清与草地贪夜蛾Sf9细胞SfCatl蛋白能够特异性结合。【结论】获得了草地贪夜蛾SfCatl完整ORF序列,分析了其特征,经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白,成功获得多克隆抗体。本研究为进一步研究该基因的功能并开发组织蛋白酶抑制剂类杀虫剂提供理论依据。

摘要：为了获得提取牦牛肉中组织蛋白酶l的最佳工艺参数,首先采用Plackett-Burman试验对影响酶活力的7个因素进行筛选,发现浸提缓冲液pH值、l-Cys浓度及(NH4)2SO4饱和度3个因素显著影响酶活力。基于该3个因素的最陡爬坡试验、中心组合设计及响应面分析结果表明:3个因素对酶活力的影响大小依次为浸提缓冲液pH值>(NH4)2SO4饱和度>l-Cys;最佳提取工艺为:浸提缓冲液pH值5.68、l-Cys浓度为6.48 mmol/l、(NH4)2SO4饱和度为76.63%。在此条件下,酶活力最高为13.98 U/mg。试验结果与模型预测值吻合良好,说明所建模型切实可行,为进一步研究牦牛肉组织蛋白酶l的提取工艺提供理论依据。

摘要：给家蚕5龄第3天幼虫分别注射藤黄微球菌(革兰阳性菌)和球孢白僵菌(真菌)进行诱导处理,利用已登录的家蚕组织蛋白酶l基因Bm Cts l(Gen Bank登录号:S77508.1)和Bm Cts l特异性抑制剂基因Bm Cts lI(Gen Bank登录号:AJ131752)的全长序列设计引物,实时荧光定量PCR检测微生物入侵后家蚕组织中Bm Cts l和Bm Cts lI基因的时空表达变化及协同反应,分析Bm Cts l酶活性变化与家蚕对微生物入侵免疫响应的相关性。家蚕的血细胞与脂肪体是微生物入侵后Bm Cts l和Bm CtslI基因出现表达变化的主要组织,其中经藤黄微球菌诱导后,血细胞中的Bm Cts l基因响应最快,且基因mRNA转录水平极显著上调,脂肪体中的Bm Cts lI基因mRNA转录水平也极显著上调。微生物入侵后蚕体组织中Bm Cts l与Bm Cts lI基因的表达变化存在时间差异,其中Bm Cts l基因先于Bm Cts lI基因上调表达,推测Bm Cts lI基因通过对微生物入侵的协同反应调控BmCts l酶活性变化。藤黄微球菌比球孢白僵菌能更快诱导Bm Cts l和Bm Cts lI基因的表达变化;2种微生物诱导下蚕体血细胞中的Bm Cts l酶活性不仅上升快,而且明显高于其他组织。上述结果提示Bm Cts l和Bm Cts lI可能与家蚕的先天免疫相关,并且佐证了家蚕的血细胞在微生物入侵后能比其他组织更快速地产生免疫响应。

摘要：目的探讨实验性脑出血(ICH)大鼠脑组织中组织蛋白酶l(Cat l)的表达及其病理意义。方法随机选取成年雄性Wistar大鼠90只,采集自体股动脉血(100μl)注射至大鼠右侧基底节制作ICH模型大鼠,另取45只大鼠(假手术组)注入100μl生理盐水。将ICH大鼠随机分为ICH组、选择性Cat l抑制剂(Z-FY-CHO)组。建模成功后2 h Z-FY-CHO组侧脑室注射二甲基亚砜(DMSO)溶解的Z-FY-CHO 2μl(1μg/μl),ICH组侧脑室注射等量DMSO溶剂。术后第3天检测各组大鼠血肿周围脑组织Cat l mRNA表达,术后第1、3、7、14天各组进行神经功能评分;采用干湿重法检测脑含水量;注射依文思蓝检测血脑屏障通透性。结果与假手术组比较,ICH组大鼠血肿周围脑组织中Cat l mRNA表达上调(P<0.05);与ICH模型组比较,Z-FY-CHO组大鼠脑组织中Cat l mRNA表达下调,大鼠神经损伤程度明显减轻,脑含水量明显降低,血脑屏障破坏程度减轻,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论实验性ICH大鼠脑组织中Cat l mRNA表达上调,Cat l抑制剂Z-FY-CHO能够抑制Cat l mRNA表达,减轻神经损伤程度,提示Cat l表达与ICH大鼠神经损伤相关。

摘要：基于分子对接和实验验证分析金银花不同溶剂提取物及主要成分抗RNA病毒蛋白酶的活性。利用TCMSP(traditional Chinese medicine systems pharmacology)构建金银花小分子配体库,采用药物分子设计模拟SYBYl 2.1.1软件分析金银花与HIV-1蛋白酶和Cathepsin l蛋白酶结合情况。通过荧光法验证金银花不同溶剂提取物(水提物、30%醇提物、60%醇提物和85%醇提物)抗HIV-1和Cathepsin l蛋白酶的活性。收集金银花22个化学成分,其中21个活性成分与HIV-1蛋白酶有较好的结合,金银花抗HIV-1蛋白酶活性强于Cathepsin l蛋白酶。金银花水提物、30%醇提物、60%醇提物和85%醇提物具有抗HIV-1的活性,IC_(50)分别为0.14、0.015、0.05、0.121 mg/ml,其中30%醇提物具有较好的抗HIV-1的活性。金银花不同溶剂提取物未发现有强烈抑制组织蛋白酶的活性,实验结果和计算机筛选结果具有一致性。初步明确金银花抗HIV-1蛋白酶和Cathepsin l蛋白酶活性,为抗病毒药物的开发及应用提供理论依据。