摘要：背景:干细胞是具有自我更新能力和高度增殖能力和多种分化潜能的较原始细胞,在一定的条件下,干细胞可以分化成机体内的多种功能细胞。胰岛干细胞和脐血间充质干细胞可以治疗相应系统的疾病,但是目前有关这两类干细胞的培养仍有困难。目的:探讨胰岛干细胞和脐血间充质干细胞分离和培养的方法,并观察在培养过程中两类干细胞的形态学变化。设计:完全随机分组设计,重复测量实验。单位:郑州大学医学院生理学教研室干细胞研究中心材料:实验于2004-04/2005-01在郑州大学医学院干细胞中心完成。选用鼠龄1～3d新生SD大鼠10～15只进行胰岛干细胞培养,采集年龄24～35岁的足月妊娠健康产妇(经过产妇知情同意)新鲜脐带血进行脐血间充质细胞的培养。方法:取新生SD大鼠,无菌条件下剖腹取胰,眼科剪反复剪切后V型胶原酶消化分离胰岛。连续转瓶法纯化胰岛。取新鲜采集脐带血,用1.077g/cm3的淋巴细胞分层液,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞。将胰岛细胞和脐血单个核细胞接种于37℃,体积分数0.05CO2培养箱内培养。于不同时间观察细胞形态的变化并通过流式细胞仪检测细胞表面分子的表达情况。主要观察指标:胰岛干细胞和脐血间充质干细胞的分离培养方法以及在细胞生长过程中的形态学变化。结果:①培养中可见梭形胰岛祖细胞贴壁呈极性生长,并且不断增殖,约12～14d长满瓶底,可连续多次传代。撤去生长因子和血清后有圆形细胞团开始形成。②从脐血中分离出的单个核细胞,培养中先出现大量的造血细胞集落,瑞士染色显示这些细胞大多数为粒系的集落,7d后出现贴壁的扁平状的上皮样细胞和长梭形的成纤维样细胞,同时有大量的破骨样细胞混杂。随着培养时间的延长,细胞数目不断增加。结论:胰岛干细胞和脐血间充质干细胞可以在体外分离和培养,用于进一步相关实验工作。

摘要：目的观察培养的大鼠结膜成纤维细胞中是否表达血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（VEGFR）。方法实验研究。健康Sprague Dawley大鼠5只，分别施行麻醉处死后，剪取球结膜组织，以组织块法接种并培养成纤维细胞。通过荧光倒置显微镜观察细胞培养情况，以间接免疫荧光法检测波形蛋白、角蛋白表达水平，对所培养的成纤维细胞进行鉴定；设计VEGF164、VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（Flk-1）3种基因的RNA引物序列，以Trizol法提取成纤维细胞中mRNA，对目的片断进行逆转录PCR扩增及凝胶电泳。扩增产物进行回收及测序，同时采用间接免疫荧光法检测VEGFR-1的表达情况。利用荧光定量PCR法观察培养的成纤维细胞中3种基因的熔解曲线和扩增曲线，同时采用间接免疫荧光法检测VEGFR-1的表达情况。结果大鼠结膜成纤维细胞中波形蛋白表达阳性，角蛋白表达阴性。逆转录PCR扩增后分别显示VEGF164、Fit-1、Flk-1条带，测序结果符合VEGF164、VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（Flk-1）基因序列。荧光定量PCR法检测结果显示上述基因均有陡直的扩增曲线，未见杂峰，指数扩增期均在30个循环内。免疫荧光法检测VEGFR-1蛋白表达阳性。结论大鼠结膜成纤维细胞存在VEGF及其受体的基因表达，有VEGFR-1的蛋白表达，抗VEGF类药物可能对大鼠的结膜成纤维细胞产生影响。

摘要：背景:成纤维细胞是构建组织工程化皮肤的种子细胞,通过电镜对各代细胞的超微结构进行了观察,以期为组织工程皮肤选择合适的种子细胞奠定基础。目的:观察正常人成纤维细胞体外培养过程中超微结构的改变。设计:自身对照观察。单位:潍坊医学院整形外科研究所、潍坊医学院附属医院普外科。材料:实验于2000-09/2002-09在潍坊医学院整形外科研究所完成。6-8岁正常男性儿童20例包皮环切术切除的健康包皮组织,均征得监护人同意自愿提供。方法:将正常人二倍体成纤维细胞进行连续传代培养,以不同代次的细胞为实验对象,通过倒置相差显微镜和透射电镜对各代细胞进行形态学及超微结构的观察。主要观察指标:①倒置相差显微镜观察的细胞的形态学改变。②透射电镜观察的成纤维细胞超微结构。结果:①倒置相差显微镜观察的细胞的形态学改变:细胞可传65～70代,成活280～300d。45代以内的细胞生长较迅速,45代后的细胞生长逐渐缓慢,65代细胞几乎无增殖趋势。②透射电镜观察的成纤维细胞超微结构:40代以内细胞的超微结构无明显变化,41～65代细胞出现核膜内折,细胞核/浆比例减小,细胞表面突起和微绒毛减少。结论:体外培养的各代成纤维细胞超微结构改变程度不同,41代后变化明显。提示构建组织工程化皮肤宜选用40代以内的成纤维细胞为种子细胞。

摘要：背景:阿胶强骨口服液治疗骨质疏松疗效肯定,但其确切作用机制有待探讨。目的:观察阿胶强骨口服液含药血清对胎鼠成骨细胞中骨保护素及保护素配体表达的影响,探讨阿胶强骨胶囊治疗骨质疏松的分子水平作用。设计:完全随机分组,对照实验。材料:实验于2003-06/2004-10在华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合骨代谢实验室完成。选用3月龄Wistar大鼠(雌雄各半)30只,随机分为3组,阿胶强骨口服液组和雌激素组及对照组,每组10只。选用清洁级新生SD大鼠12只用于成骨细胞的分离和培养。方法:①各组Wistar大鼠灌胃7d后,制备各组的含药血清。②将清洁级新生SD大鼠分离的颅骨成骨细胞,制成单细胞悬液,消化传代,取二代培养的成骨细胞,制成细胞悬液。培养细胞被分为5组,分别加同体积药液。阿胶强骨口服液组分别加入用培养液稀释为100和500及1000g/L浓度的阿胶强骨口服液含药血清;雌激素组分别加入100及1000g/L替勃龙含药血清;对照组仅加培养液。同时各组再加入含100g/L小牛血清的培养液,继续培养。③采用四甲基偶氮唑盐比色分析法、3H-胸腺嘧啶核苷掺入法测定成骨细胞增殖,用放免法测定细胞内骨钙素含量,反转录聚合酶链反应测定胎鼠成骨细胞中骨保护素及保护素配体mRNA的表达。④组间比较采用单因素方差分析。主要观察指标:胎鼠成骨细胞经阿胶强骨口服液或利维爱含药血清干预后,细胞中骨保护素及保护素配体mRNA的表达。结果:①成骨细胞增殖四甲基偶氮唑盐比色分析法及3H-胸腺嘧啶核苷测定结果:阿胶强骨口服液组和替勃龙组各药物血清组明显高于对照组(P<0.05～0.01),并在500g/L时达到最大效应(P<0.01),当浓度大于500g/L时,其作用趋于饱和。各浓度阿胶强骨口服液及替勃龙含药血清均可增加成骨细胞骨钙素含量(P均<0.05)。②骨保护素基因mRNA表达:阿胶强骨口服液组含药血清1000g/L时最强,明显高于100和500g/L(P<005),阿胶强骨口服液组含药血清1000g/L及雌激素组含药血清100和1000g/L明显高于对照组(P<001)。③RANKL基因表达:阿胶强骨口服液组含药血清1000g/L时最强,明显低于100和500g/L(P<005),阿胶强骨口服液组含药血清1000g/L及雌激素组含药血清100和1000g/L明显低于对照组(P<001)。结论:①阿胶强骨口服液对成骨细胞的增殖有明显的促进作用,并且这种作用呈现剂量依赖性和可饱和性,与替勃龙相近。②阿胶强骨口服液治疗骨质疏松疗效机制之一可能与其促进成骨细胞的增殖,调节OPG/RANKL表达有关。

摘要：背景:成纤维细胞是构建组织工程化皮肤的种子细胞,其质量好坏直接影响组织工程化皮肤的质量。其在体外培养过程中胶原基因表达及对表皮细胞生长因子刺激反应,可以反映不同代次成纤维细胞的增殖能力,为皮肤组织工程筛选合适的种子细胞提供依据。目的:观察体外培养不同代次人成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的表达及对表皮细胞生长因子刺激的反应性,为组织工程化皮肤种子细胞的选择提供部分依据和参数。设计:自身对照实验。单位:潍坊医学院整形外科研究所。材料:实验于2000-09/2002-06在潍坊医学院整形外科研究所完成。实验样本来源于在潍坊医学院附属医院普外科行包皮环切术的6～8岁正常男性儿童(n=20)切除的健康包皮组织,均自愿提供。方法:①成纤维细胞培养:取包皮组织,去除皮下疏松结缔组织,分离真皮和表皮,真皮部分用含100mL/L胎牛血清DMEM培养液终止胰蛋白酶作用,再用200U/mLⅠ型胶原酶37℃条件下消化30min,收集细胞悬液,用血细胞计数板做细胞计数,观察细胞活性,接种于培养皿中,细胞培养达到80%汇合时,用混合消化液消化,镜下见胞质回缩终止消化,以1:2接种入新培养皿,进行传代培养。②细胞鉴定:用相差显微镜动态观察细胞形态变化及生长增殖情况、透射电镜及抗vimentin免疫细胞化学染色。③不同代次成纤维细胞胶原基因表达的分析:抽提不同代次(P0,P5,…,P65)成纤维细胞总核糖核酸,获得样本cDNA,进行逆转录聚合酶链反应,所得反应产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳对照分子量标准,分析扩增产物是否为所预期。④氚-胸苷(3H-TdR)掺入量测定对表皮生长因子刺激的反应性:取P10和P60代成纤维细胞,实验组均添加含表皮生长因子的条件培养液,对照组用不加表皮生长因子的条件培养液。细胞培养至80%汇合时,血清饥饿72h。加入含200μL/L表皮生长因子无血清DMEM培养液,培养24h;弃上清,各组均加入含氚-胸苷的培养液37MBq/L,再培养24h,收集细胞;用预冷的100g/L三氯乙酸沉淀DNA,再用0.5mL1mol/LNaOH提取,液闪计数仪上测定每分钟放射性脉冲数。主要观察指标:①不同代次成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA含量。②不同代次成纤维细胞对表皮细胞生长因子刺激的反应。结果:①不同代次成纤维细胞胶原基因的表达:随细胞代次的增加,Ⅰ,Ⅲ型胶原mRNA含量逐渐降低。②不同代次成纤维细胞对表皮细胞生长因子刺激的反应:氚-胸苷掺入量在P60细胞(实验组:132.5±23.6,对照组:124.9±16.8)均低于在P10细胞中(实验组:512.8±56.4,对照组:306.4±22.5);对于P60细胞,实验组与对照组间差异无显著性意义(P>0.05),对于P10细胞,实验组与对照组间的差异有非常显著性意义(P<0.01)。结论:①随成纤维细胞代龄的增加,其合成Ⅰ型和Ⅲ型胶原的量逐渐降低。②P60细胞对表皮细胞生长因子刺激的反应均低于P10细胞,添加表皮细胞生长因子的条件培养液对P60细胞生长增殖无明显调控作用,对P10细胞有非常显著的促增殖作用。提示:随着细胞代次的增加,氚-胸苷掺入量降低,表皮细胞生长因子对衰老成纤维细胞生长增殖的调控能力减弱。③本实验为建立成纤维细胞衰老模型提供了实验依据,同时也为组织工程学、老年学及肿瘤生物学及发展提供科学依据。

摘要：背景:骨髓基质细胞是贴壁黏附的非造血多潜能干细胞,其在一定条件体外培养、扩增可被诱导分化为神经元和胶质细胞。目的:观察家猫骨髓基质细胞体外培养及诱导分化成神经干细胞的生长情况。设计:随机取样。单位:南方医科大学附属珠江医院神经外科。材料:实验于2002-01/12在解放军第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所中心实验室进行,实验动物是由第一军医大学动物中心提供健康家猫20只,年龄1.0～2.0岁,体质量2.5～4.0kg,雌雄各半。干预:随机抽取家猫左右下肢的骨髓,从中分离得到骨髓基质细胞,提取的骨髓基质细胞悬液在体外给予神经干细胞培养基培养,增殖后用维甲酸为分化诱导因子进行诱导骨髓基质细胞向神经干细胞转化。CK2型倒置相差光学显微镜(OLYMPAS,JAPAN)追踪观察活细胞培养生长情况,同时观察4,12,24,48h去除非贴壁细胞及不去除贴壁细胞骨髓基质细胞生长情况。采用免疫组织化学染色改良法对干细胞阶段的骨髓基质细胞进行免疫细胞化学检测,OLYMPAS光学显微镜观察。主要观察指标:对接受实验干预的骨髓基质细胞分别进行倒置相差显微镜下观察活细胞生长情况及光镜下观察免疫细胞化学染色情况。结果:20只家猫全部进入结果分析。猫骨髓基质细胞在体外培养中胞体增大,倒置相差显微镜下可见丰富的胞浆颗粒,继之出芽,贴壁生长,可形成克隆团,同时可传代培养。免疫组化染色分析结果显示能表达神经干细胞特异性抗原Nestin,而且能分化出胶质细胞样细胞和神经元样细胞。结论:家猫骨髓基质细胞具有干细胞特征,在合适条件下可扩增、形成克隆并诱导分化出神经胶质细胞和神经元特征细胞。

摘要：背景:目前有关表皮细胞体外衰老的文献报道甚少,而表皮细胞是构建组织工程化皮肤所必需的种子细胞,文章拟对正常人表皮细胞老化过程中的生物学特性加以阐述,为组织工程化皮肤选择合适的种子细胞奠定基础。目的:通过研究表皮细胞体外增殖与老化规律,为选择合适的组织工程化皮肤种子细胞提供依据。设计:自身对照实验。单位:潍坊医学院整形外科研究所,潍坊医学院附属医院普外科。材料:实验于2000-09/2002-09在潍坊医学院整形外科研究所完成。实验样本来源于在潍坊医学院附属医院普外科行包皮环切术的6～8岁正常男性儿童20例切除的健康包皮组织,监护人获完全同意,将包皮标本用于表皮细胞增殖培养实验。方法:取正常年轻人表皮细胞进行传代培养,以不同代龄细胞为实验对象,采用形态学观察、群体倍增时间、免疫细胞化学及β-半乳糖苷酶染色的方法,检测表皮细胞老化规律。主要观察指标:①表皮细胞生长特性的改变。②表皮细胞形态学改变。③表皮细胞表型的改变。结果:①表皮细胞生长特性的改变:体外单层培养9代,P2的群体倍增时间最短,前5代增殖能力较强,P5以后群体倍增时间明显延长,P8细胞不再增殖。②表皮细胞形态学改变:原代细胞接种3d后开始增殖,4d后细胞加速增殖,培养1周左右细胞接近融合。显微镜、免疫组化鉴定,符合表皮细胞的特点。③表皮细胞表型的改变:随着细胞的连续传代培养,β-半乳糖苷酶组化表达呈现从弱(在年轻细胞中占9%)到强(在老化细胞中占65%)的趋势,β-半乳糖苷酶染色的阳性率和细胞代龄之间呈显著正相关(r=0.87,P<0.01)。结论:①与年轻细胞相比,老化细胞具有衰老形态和酶细胞化学特征的增多;在细胞从年轻向老化发展的进程中,细胞群体倍增时间呈延长的趋势。②与年轻细胞相比,老化细胞中β-半乳糖苷酶的表达显著增强,且这种增强与细胞衰老表型的出现和细胞增殖能力的丧失相平行,反应细胞的老化程度。③本实验建立了体外培养正常人表皮细胞的衰老模型,第1～5代表皮细胞(供者年龄16～18岁)可作为构建组织工程化皮肤的种子细胞。

摘要：背景:血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)是诱导心肌肥大的强刺激因子,血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)也是致心肌肥大因素之一,AngⅡ是否可以通过诱导PDGF受体表达进一步促使心肌肥大?目的:探讨丝裂素活化蛋白激酶在AngⅡ致心肌细胞肥大的作用,为心肌肥大的防治提供理论依据。设计:以分离纯化培养的Wistar乳鼠心肌细胞为研究对象的对照性实验研究。单位:一所大学的病理生理教研室。材料:实验在北京大学医学院病理生理学实验室进行。实验动物为80只出生1～3d的Wistar乳鼠(北京大学医学部动物中心提供),雌雄不限。均在细胞培养室取出心脏做心肌细胞培养。干预:分离纯化培养的乳鼠心肌细胞,分为3组,以1×10-7mol/LAngⅡ刺激为AngⅡ组;以1×10-5mol/LPD98059(一种丝裂素活化蛋白激酶抑制剂)预孵育30min后再用AngⅡ刺激为PD98059组;以正常的乳鼠心肌细胞为对照组。培养24h后采用免疫印迹法测定每组心肌细胞PDGF-β受体的含量。主要观察指标:各组心肌细胞PDGF-β受体的含量。结果:AngⅡ刺激培养24h的乳鼠心肌细胞PDGF-β受体表达(432.41±54.08)和对照组(197.65±44.10)比较增强,差异有显著性意义(q=6.77,P<0.01),PD98059组PDGF-β受体表达(317.2±21.12)与AngⅡ组比较明显下降,差异?

摘要：背景:中枢神经再生失败的主要原因之一是损伤后中枢神经内的微环境(缺乏生长所需的神经营养因子、分泌产生抑制因子、胶质瘢痕形成等)不利于轴突的再生。为了促进中枢神经系统损伤后轴突再生,改善损伤区再生微环境很重要。其中嗅鞘细胞是近年来最为吸引人注目的一种治疗中枢神经损伤的有力工具。目的:探讨嗅鞘细胞在大鼠颅脑损伤中的作用及其是否能在颅脑损伤后减少神经功能上的缺失。设计:以实验动物为研究对象,随机对照实验研究。单位:一所大学医院的神经外科。材料:实验在2003-04/08在开封铁路医院神经外科中心实验室完成。选用成年健康Spraque-Dawley大鼠100只,雌雄不拘,体质量250～350g,随机分为正常组,脑损伤组,生理盐水组,嗅鞘细胞组。每组25只。每组再分为5个亚组,每个亚组5只大鼠。干预:制备颅脑损伤的大鼠模型,在受伤后立即将嗅鞘细胞移植到受损的脑组织中,1,4d,1,2,4周对大鼠进行神经损伤评分,将大鼠处死观察嗅鞘细胞在脑组织中的分布情况。主要观察指标:①大鼠的神经功能恢复情况。②嗅鞘细胞在脑组织中的分布情况。结果:在术后2,4周时,嗅鞘细胞组NSS评分与脑损伤组和生理盐水组相比,差异有显著性意义。通过苏木精-伊红染色切片中的形态结构或GFAP和p75免疫化学。

摘要：背景:二倍体成纤维细胞常用于研究细胞水平的衰老,β-半乳糖苷酶是鉴别衰老细胞的标志酶,本实验拟观察正常人成纤维细胞在体外培养过程中β-半乳糖苷酶的变化情况。目的:建立一个稳定的二倍体成纤维细胞体外培养体系,了解正常人成纤维细胞老化过程中β-半乳糖苷酶的变化规律。设计:自身对照实验。单位:潍坊医学院整形外科研究所、潍坊医学院附属医院普外科。材料:实验于2000-09/2002-09在潍坊医学院整形外科研究所完成。实验样本来源于在潍坊医学院附属医院普外科行包皮环切术的6～8岁正常男性儿童(n=20)切除的健康包皮组织。方法:①成纤维细胞培养:取包皮组织,分离真皮和表皮,真皮部分用含100mL/L胎牛血清DMEM培养液终止胰蛋白酶作用,再用200U/mLⅠ型胶原酶37℃条件下消化30min,收集细胞悬液,接种于培养皿中,细胞培养达80%汇合时进行传代培养。②细胞鉴定:用相差显微镜观察细胞形态变化及生长增殖情况、透射电镜及抗vimentin免疫细胞化学染色。③细胞生物学行为的观察对比:取生长状态良好的细胞,按群体倍增水平分为两组,第一组代表年轻细胞,采用10代龄;第二组代表老化细胞,采用65代龄。进行消化传代,分别按2×104,4×104分别接种于24孔培养板内。每隔24h消化计数,每次每组计数3孔,计算均值。共记数8d,以培养时间为横轴,细胞数为纵轴,绘制生长曲线并计算细胞的群体倍增时间。④β-半乳糖苷酶组化检测及阳性细胞的半定量分析:成纤维细胞每5n代龄(共13代)作细胞爬片,漂洗,加入SA-β-gal染色液,37℃孵育48h。在显微镜下观察计数,蓝染细胞为阳性细胞,每次随机挑选视野计数500个细胞,得到阳性细胞百分率。主要观察指标:①正常人成纤维细胞生物学行为的改变。②正常人成纤维细胞老化过程中β-半乳糖苷酶的表达。结果:①正常人成纤维细胞生物学行为的改变:细胞生长曲线显示,老化细胞生长速度较年轻细胞明显减慢。年轻细胞最大增殖数约为47.3×105,对数生长期在3.0～6.0d,细胞倍增时间为2.18d。老化细胞最大增殖数各为8.5×104,对数生长期分别在4.0～7.5d,细胞群体倍增时间依次为3.86d。②正常人成纤维细胞老化过程中β-半乳糖苷酶的表达:与年轻细胞组(阳性细胞率=4%)相比,衰老细胞组中阳性细胞率(60%)大为增强。直线相关分析结果显示,β-半乳糖苷酶染色的阳性率和细胞代龄之间呈显著正相关(r=0.92,P<0.01)。结论:在正常人成纤维细胞从年轻向老化发展的过程中,细胞群体倍增时间呈增高的趋势;与年轻细胞相比较(占4%),β-半乳糖苷酶的表达在老化细胞中显著增强(占60%),且这种增强与细胞衰老表型的出现和细胞增殖能力的丧失相平行,可反应细胞的老化程度。本实验为建立成纤维细胞衰老模型提供了实验依据,同时也为老年学及肿瘤生物学甚至组织工程学发展提供科学依据。