摘要：背景:低剂量活性氧可以促进正常细胞和肿瘤细胞增殖、分化,但目前对此过程中所涉及的信号途径及其与细胞敏感时相的关系尚认识不足。目的:通过阻断细胞内NF-κB途径和诱导不同细胞时相,观察过氧化氢促进HepG2细胞增殖与NF-κB途径和细胞敏感时相的关系,为抑制、干预肿瘤细胞的生长及改善患者预后功能提供理论依据。设计:完全随机实验研究。单位:解放军第四军医大学预防医学系毒理学教研室。对象:实验于2004-04/2004-08在解放军第四军医大学预防医学系毒理学教研室完成,对象为人肝癌细胞株HepG2细胞,由解放军第四军医大学基础部病理学教研室惠赠。方法:以不同剂量过氧化氢直接作用于培养的HepG2细胞,筛选能够促进HepG2细胞增殖的过氧化氢浓度。用50μmol/L的过氧化氢分别处理经NF-κB抑制剂(PDTC)预处理的HepG2细胞和用胸腺嘧啶核苷同步化得到的G1,G2/M,S期HepG2细胞。主要观察指标:细胞分别经过氧化氢处理1,24,48h后,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞吸光度值,比较细胞增殖活性。结果:50μmol/L的过氧化氢作用HepG2细胞24h后,MTT实验所测吸光度值与对照组相比显著升高(t=0.001,P<0.01)。20μmol/LPDTC预处理HepG2细胞2h后,给予50μmol/L过氧化氢作用细胞。

摘要：目的探讨美洛昔康对鼻咽癌细胞株CNE-1生长抑制及诱导凋亡的作用。方法应用肿瘤细胞培养技术,随机分组和空白对照设计,培养不同时间后,用MTT法、AO+EB染色法、流式细胞仪检测法,观察美洛昔康对CNE-1生长抑制的剂量和时间效应,分析细胞凋亡发生率,细胞免疫荧光法检测细胞内COX-2蛋白的表达。结果美洛昔康能抑制CNE-1细胞的生长。美洛昔康处理CNE-1细胞后,细胞呈凋亡特征性改变。流式细胞分析显示美洛昔康呈浓度依赖性诱导CNE-1细胞凋亡。细胞免疫荧光结果表明美洛昔康处理细胞后,随药物浓度的增加,COX-2蛋白表达下降。结论美洛昔康具有抑制CNE-1细胞生长,诱导CNE-1细胞凋亡的作用,其机制可能与COX-2蛋白有关。

摘要：目的研究组织贴壁法原代培养结膜松弛症球结膜成纤维细胞,并对细胞进行鉴定,为结膜松弛症体外实验提供大量的细胞。设计实验研究。研究对象体外培养的人结膜松弛症球结膜成纤维细胞。方法以结膜松弛症患者手术切除的球结膜为材料,采用组织贴壁法培养细胞,胰酶消化、传代,并对细胞进行形态学观察、免疫荧光鉴定、流式细胞术检测成纤维细胞胞浆特异性蛋白的表达。主要指标细胞形态、结构、纯度。结果组织块贴壁法原代培养2～5天见组织块能紧密贴附于六孔板,倒置显微镜下观察组织块周围有细胞溢出,10～15天即可见细胞增生,细胞呈马赛克样,界线不清。传代至第2代细胞倒置显微镜下观察形态一致,大小均一,呈放射状排列,为长梭形或两头尖的长条状,胞质中有一个卵圆形的细胞核,周围有长短不等的细胞突起相互交联。细胞免疫化学染色,荧光显微镜下可见结膜松弛症球结膜成纤维细胞Vimentin表达阳性,Keratin(C11)表达阴性。流式细胞术检测成纤维细胞Vimentin表达阳性,Keratin(C11)表达阴性。结论采用组织贴壁法培养能够获得稳定的结膜松弛症球结膜成纤维细胞,经形态学观察、免疫荧光鉴定及流式细胞术检测为结膜松弛症球结膜成纤维细胞。

摘要：目的:研究人CYP3A4与POR和cyt b5用悬浮细胞共表达时的最佳条件。方法:悬浮培养Sf 9细胞,分别摸索摇床的温度、转速、摇瓶中细胞液的量、表面活性剂的加量、细胞的培养时间,以及3种病毒的加量比例等条件,并进行优化;然后,将表达产物制成微粒体后用于睾酮的代谢,并分别测其代谢活性。结果:当恒温摇床的温度为27℃,转速为90 r/min,每250 ml摇瓶中加入80～120 ml细胞密度为5×105个/ml的细胞液,并加入0.1%的PluronicF-68,细胞培养72 h时,最适合细胞的生长和目的蛋白的表达。此时,当3种病毒的加量比例为1∶1∶1时,表达条件最佳,其对底物睾酮代谢的Km值、Vmax和CLint分别为119.6μmol/L、0.52μmol/(min.g蛋白)和4.34 ml/(min.g蛋白)。结论:通过三重共表达CYP3A4、POR、cyt b5,以及对表达条件的优化,提高了目的蛋白的表达量,得到了较高代谢活性的CYP3A4,从而为新药代谢及药物-药物相互作用研究奠定了基础,为药物代谢酶的大量表达提供了可行的方案。

摘要：目的通过正交试验设计研究四种主要因素对软骨细胞增殖的影响，探讨海藻酸钠胶体复合载体体外培养软骨细胞增殖的最佳配比培养体系，为组织工程种子细胞的研究提供实验依据。方法建立单层贴壁和海藻酸钠复合载体立体培养细胞模型，采用正交试验4因素2-wav和4因素3-way设计，用XTT方法检测软骨细胞在一定浓度的复合因子包括碱性成纤维细胞生长因子、透明质酸钠、纤维连接蛋白、壳聚糖的完全培养基中的增殖情况；采用倒置、相差、激光共聚焦显微镜的形态学观察；采用LDH检测复合材料对细胞的毒性反应，确定体外培养体系方案。结果正交试验设计能确定各因素的有效浓度及配比方案，其中碱性成纤维细胞生长因子与透明质酸有共协同作用，在DMEM／Ham＇s F12复合培养基的海藻酸钠载体支架中培养软骨细胞能快速增殖，细胞数48h就增殖3倍多，Safranine O GAG染色显示传至9代仍然产生大量蛋白聚糖基质；LDH检测未见毒副作用；该复合载体具有良好的成形性和组织相容性。结论在DMEM／Ham＇s F12复合培养基的海藻酸钠载体中培养能快速增殖并有利于维持软骨细胞表型及功能的表达。

摘要：目的:探讨磁珠法提取基因组DNA的影响因素,建立快速、高效、批量提取全血基因组DNA的优化方案。方法:使用磁珠法核酸自动提取系统从全血中提取基因组DNA,紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。采用正交试验设计分析裂解时间、全血量、磁珠量和乙醇浓度4个因素的主效应和全血量与裂解时间、磁珠量,裂解时间与磁珠量的二阶交互作用对所提取DNA浓度和纯度的影响。结果:裂解时间、全血量、磁珠量和乙醇浓度4个主效应对DNA浓度的影响均存在统计学差异(P<0.05),当裂解时间为15 min,全血量为100μl,磁珠量为80μl,乙醇浓度为80%时,DNA平均浓度最高。磁珠量、裂解时间和全血量的交互作用对DNA OD260/OD280的比值有影响(P=0.008和P=0.013)。当磁珠量为40μl,裂解时间为15 min,全血量为100μl时,OD260/OD280的比值较好。磁珠量和乙醇浓度影响DNA OD260/OD230的比值(P=0.017和P<0.05),磁珠量为40μl,乙醇浓度为80%时,OD260/OD230的比值更好。结论:当DNA得率优先考虑时,可以选择裂解时间15 min、全血量100μl、磁珠量80μl、乙醇浓度80%的提取条件;而对DNA纯度要求较高时,可以将磁珠量改为40μl,以获得最优DNA提取效果。

摘要：目的探讨改良的新生大鼠海马神经元细胞体外培养方法,为新生儿缺血性脑损伤模型等海马神经元相关疾病研究奠定基础。方法采用本研究自行设计的改良新生大鼠海马神经元细胞的体外培养方法,进行新生大鼠海马神经元细胞的体外培养。判断新生大鼠原代海马神经元细胞体外培养成功的标准为:荧光显微镜下,可见微管相关蛋白(MAP)2在海马神经元细胞体和树突中表达。该改良方法具体为:1以L-多聚赖氨酸和鼠尾胶原作为神经元细胞体外培养的生长基质,分离出生24h内新生SD大鼠海马结构。将其运用单一胰蛋白酶水浴振荡消化后,吹打成细胞悬液,将海马神经元细胞以适当的密度种植于含10%胎牛血清DMEM培养基中,贴壁培养4h后,更换为Neurobasal维持培养基继续培养,以后每3d更换1/2培养液。2采用抗MAP2-5-异硫氰酸荧光素(anti-MAP2-FITC)免疫荧光法,对所获得的海马神经元细胞进行鉴定。结果 1新生大鼠海马神经元细胞的体外培养结果显示,新生大鼠海马神经元细胞于培养30min时,大部分细胞贴壁生长,培养2h后,细胞贴壁明显,少数细胞开始长出突起。于培养5d后,神经元突起进一步增多,并形成神经细胞网络,培养7d后,神经元细胞分化更加成熟,神经元细胞之间的突起联系更加紧密,可见密集的神经细胞网络。海马神经元细胞体外培养至第21天后,神经元细胞开始退化、变性,细胞体皱缩,残留细胞体痕迹,周围光晕消失,折光性减弱,突起融合而粗大杂乱,神经细胞网络粗大老化。2anti-MAP2-FITC免疫荧光法对所获得的海马神经元细胞进行鉴定的结果显示,在所有细胞中,免疫荧光染色MAP2阳性新生大鼠海马神经元细胞纯度达96.3%。结论通过上述改良方法培养获得的新生大鼠海马神经元细胞生长状态良好,并具有较高的纯度,可为进一步进行新生儿缺血性脑损伤模型等海马神经元相关疾病的研究提供实验条件。

摘要：目的构建帕金森病PINK1基因真核表达载体pcDNA3．1-mye／PINK1，检测其转染COS-7细胞后的表达。方法用PCR方法从人cDNA文库DNA中扩增PINK1全长cDNA，该基因片段两端设计了EcoR I和BamH I限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将PINK1的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3．1-myc—his（-）B上，酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术将所构建的载体导入COS-7细胞中，体外培养，于转染48h后利用RT—PCR和Western Blotting方法检测目的基因的表达情况。主要观察指标：（1）PINK1基因cDNA扩增产物检测。（2）pcDNA3．1-myc／PINK1重组体酶切鉴定。（3）Western—blotting。结果经琼脂糖凝胶电泳及测序证实，PCR获得的片段与GenBank中登记的PINK1序列完全相同；pcDNA3．1-myc／CHIP酶切片段的长度与理论大小相符；转染48h后的COS-7细胞可检测到PINK1蛋白的表达。结论PINK1蛋白真核表达载体构建成功，在COS-7细胞中可获得表达。

摘要：背景:氯氮平所致的糖代谢障碍越来越引起内分泌科医生的关注,胰岛素抵抗被认为与其发生有关,那么氯氮平是否也直接影响胰岛分泌功能。目的:观察不同浓度氯氮平在不同条件下对体外培养大鼠胰岛分泌功能的影响。设计:完全随机分组设计,对照实验,采用一元方差分析比较实验组和对照组之间的差异,采用LSD-t检验作多个样本间的两两比较(多重比较)。单位:武汉大学人民医院精神卫生中心。材料:实验于2003-09/2004-01在武汉大学口腔医院实验中心完成。选用清洁级健康雄性Wistar大鼠3只。方法:①采用经典的胶原酶消化法分离、纯化胰岛。②以含2g/L牛血清白蛋白和3.3mmol/L葡萄糖的Hanks液每孔1mL,预孵育30min,弃上清。每12孔为一组,共5组:对照组的孵育液含1g/L二甲基亚砜、3.3mmol/L或16.7mmol/L的葡萄糖液1mL;4个不同浓度氯氮平组的孵育液除含有上述成分外,还分别含浓度为0.2,1.0,5.0或10.0μmol/L氯氮平;各组有6孔继续孵育1h,另外6孔继续孵育4h;吸取上清液,保存于-20℃冰箱中待测。重复3次。采用放射免疫分析法测定上清液中胰岛素分泌量。③采用一元方差分析(ANOVA)比较实验组和对照组之间的差异,采用LSD-t检验作多个样本间的两两比较(多重比较)。主要观察指标:培养液葡萄糖浓度为3.3,16.7mmol/L,作用1,4h各组胰岛素分泌量比较。结果:①培养液葡萄糖浓度为3.3mmol/L,培养1h,氯氮平各浓度组胰岛素分泌量与对照组相近(P>0.05);培养4h,4种浓度氯氮平组胰岛素分泌量明显低于对照组犤(0.92±0.4),(1.02±0.3),(1.06±0.4),(0.74±0.2),(1.66±0.4)mU/IEQ,P0.05)。②培养液葡萄糖浓度为16.7mmol/L,培养1和4h,4种浓度氯氮平组胰岛素分泌量均与对照组相近(P>0.05)。结论:氯氮平抑制基础胰岛素分泌,与剂量无关。

摘要：背景:Neurturin对多巴胺能神经元、运动神经元、感觉神经元、交感神经元等多种神经元具有促进存活及保护作用的研究报道甚多,关于Neur-turin对胆碱能神经元的影响报道较少。目的:探讨神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)和Neurturin联合应用对体外培养的神经生长因子受体阳性神经元生长发育的影响。设计:以细胞为研究对象,重复测量,验证性研究。单位:一所大学的解剖学教研室。材料:实验于2001-09/2002-06在广州医学院人体解剖教研室完成。新生的SD大鼠,培养液采用DMEM/F12培养基,另加20g/L无血清添加剂,抽滤灭菌后备用。方法:实验分4组:NGF组,NTN组,NGF+NTN组及对照组。前3组分别加入NGF,NTN,NGF+NTN,使其各浓度达到100μg/L。对照组加培养液替代。神经元原代培养新生大鼠基底前脑胆碱能神经元,然后用免疫组化结合图像分析技术观察Neurturin,NGF对培养的新生大鼠基底前脑胆碱能神经元生长发育的作用。主要观察指标:培养4,8d时新生大鼠前脑的NGFR阳性神经元存活情况和生长情况。结果:培养4d时,NTN组的各项指标均与对照组有显著性差异(P0.05),NGF+NTN组各项指标仍然优于NGF组或NTN?