摘要：生命活动包括细胞分化、生长、衰老、死亡等一系列变化,是一个连续发展的过程,而在当前的细胞生物学实验教学中,针对独立、单个知识点的实验设计仍占多数,这不利于学生系统、有机地理解生命现象。该研究以U-937细胞分化过程为对象,设计了3个相互联系的实验,分别为:(1)分化对细胞形态影响的观察;(2)分化对细胞周期影响的观察;(3)分化对细胞吞噬功能影响的观察。通过对实验结果的观察,学生发现分化后,(1)细胞由悬浮生长转变为贴壁生长,细胞形态由圆形变为不规则多边形,并伸出伪足;(2)细胞周期则会发生G1/S期阻滞,停留在G1期;(3)分化后的细胞对细菌的吞噬能力明显增强。该教学设计巧妙地将3个知识点有机整合在一起,旨在通过细胞分化这一生命现象,让学生深入理解细胞在发育成熟过程中形态学、分裂增殖及吞噬功能的变化,帮助学生充分理解生命活动是动态发展这一本质,且能很好地培养学生全面思考、分析及解决问题的能力,进而提升学生对教学实验的兴趣,发挥学习的主观能动性。

摘要：通过“细胞分化地景模型”的应用和课堂教学中的有效组织,学生主动发现问题,以小组合作探究的形式解决问题,突破了细胞分化的实质、细胞的全能性和干细胞等重难点。具有真实感和立体感的模型使得微观、抽象的知识以具象的实物形式及演示过程呈现,切实提高了课堂学习效率,提升了学生的生物学学科核心素养。

摘要：目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子C(VEGF-C)在骨髓间充质干细胞(BMSC)向淋巴管内皮细胞(LEC)分化中的作用. 方法 取第3~5代大鼠BMSC进行实验.(1)取大鼠BMSC,采用随机数字表法(分组方法下同)分为阴性对照组、CD90组、CD44组、CD34组,每组样本数为3,阴性对照组细胞加入磷酸盐缓冲液5μL,余3组细胞分别加入相应抗体5 μL,流式细胞仪检测细胞表面抗原阳性情况.(2)取3个批次大鼠BMSC,均分为空白对照组、VEGF-C组、HGF组、bFGF组、VEGF-C+HGF组、VEGF-C+bFGF组、HGF+bFGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组,每组样本数为3.空白对照组细胞加入2 mL完全培养基,VEGF-C组细胞中加入2 mL完全培养基和10 μg/mL VEGF-C 10 μL,HGF组细胞加入2 mL完全培养基和10 μg/mL HGF 16 μL,bFGF组细胞加入2 mL完全培养基和1μg/mL bFGF 20 μL,VEGF-C+ HGF组、VEGF-C +bFGF组、HGF+ bFGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组细胞加入2 mL完全培养基及同前相应浓度和量的诱导因子.培养10d,倒置相差显微镜下观察细胞形态,蛋白质印迹法和实时荧光定量反转录PCR法分别检测淋巴管内皮透明质酸受体1(LYVE-1)、VEGF受体3(VEGFR3)及整合素α9蛋白和mRNA表达.(3)取大鼠BMSC,分为空白对照组、HGF+ VEGF-C+ bFGF组、bFGF+ VEGF-C+HGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组,每组样本数为3.空白对照组细胞加入2 mL完全培养基;HGF+VEGF-C +bFGF组细胞加入2 mL完全培养基、10 μg/mL HGF 16 μL、10 μg/mL VEGF-C 10μL,6h后加入1 μg/mL bFGF 20 μ***+VEGF-C+HGF组细胞加入2 mL完全培养基以及1μg/mLbFGF 20 μL和10 μg/mL VEGF-C 10 μL,6h后加入10 μg/mL HGF 16 μL;VEGF-C+ HGF+ bFGF组细胞同时加入2 mL完全培养基及同前浓度及量的3种诱导因子.另取2个批次大鼠BMSC,同前进行分组,除将HGF+ VEGF-C+ bFGF组、bFGF+ VEGF-C+ HGF组6h的间隔时间调整为12、24 h外,其余处理方法同前.培养10 d,蛋白质印迹法检测LYVE-1、VEGFR3及整合素α9的蛋白表达.对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正. 结果 (1)阴性对照组、CD90组、CD44组、CD34组细胞表面抗原阳性表达率分别为0.39%、99.84%、99.90%、0.57%.(2)培养10 d,空白对照组、HGF组、bFGF组、HGF+ bFGF组细胞呈长梭形,其余各组细胞呈多边形.(3)培养10d,空白对照组、HGF组、bFGF组、HGF+ bFGF组细胞无LYVE-1、VEGFR3和整合素α9蛋白表达.培养10 d,VEGF-C+ HGF+ bFGF组细胞LYVE-1、VEGFR3和整合素α9的蛋白表达量均明显高于VEGF-C组(t=24.21、11.04、15.43,P<0.01)、VEGF-C+ HGF组(t=10.81、9.93、10.20,P <0.01)、VEGF-C+ bFGF组(t=11.67、6.32、19.00,P<0.01). VEGF-C +HGF组及VEGF-C+bFGF组细胞LYVE-1的蛋白表达量明显高于VEGF-C组(t=8.69、15.20,P<0.01);VEGF-C+bFGF组细胞VEGFR3的蛋白表达量明显高于VEGF-C组及VEGF-C+HGF组(t=8.67、7.21,P<0.01);VEGF-C+ HGF组细胞整合素α9的蛋白表达量明显高于VEGF-C组及VEGF-C+ bFGF组(t=8.80、8.83,P<0.01).(4)培养10d,空白对照组、HGF组、bFGF组、HGF+ bFGF组细胞均无LYVE-1、VEGFR3和整合素α9 mRNA表达.培养10d,VEGF-C组细胞LYVE-1、VEGFR3的mRNA表达量明显低于VEGF-C+ bFGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组(tLYVE-1=6.22、18.01,tVEGFR3=8.49、15.34,P<0.01),整合素α9的mRNA表达量明显低于VEGF-C+ HGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组(t=13.24、9.65,P<0.01).VEGF-C+HGF+

摘要：背景:研究表明,树突状细胞接受刺激的性质和微环境及其起源是决定免疫反应中初始CD4+T细胞发生Th1或Th2应答的关键因素,树突状细胞是否成熟对其功能的发挥影响很大。目的:观察广泛应用的细胞因子α-干扰素对人外周血单核细胞向树突状细胞分化成熟的影响。设计、时间及地点:细胞水平的观察对照实验,于2007-05/12在深圳市人民医院临床医学研究中心实验室完成。材料:取10名健康成人志愿者的外周血。方法:采集外周血10mL,肝素抗凝,常规淋巴细胞分离液分离单核细胞,然后将单核细胞与粒-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4体外培养7d。分3组进行树突状细胞培养,对照组不加α-干扰素;100U/Lα-干扰素组于培养第5天加入100U/L的α-干扰素;300U/Lα-干扰素组于培养第5天加入300U/L的α-干扰素。主要观察指标:培养第7天用流式细胞术检测树突状细胞膜表面CD83和MHC-DR表达水平;应用四氮唑盐法测定树突状细胞刺激同种异体T细胞增殖的能力;采用酶联免疫吸附法检测树突状细胞培养上清中白细胞介素12p40+p70含量。结果:100,300U/Lα-干扰素组中CD83+和MHC-DR+树突状细胞的数量、刺激同种异体T细胞增殖的能力及培养上清液中白细胞介素12p40+p70水平均显著高于对照组(P<0.01),并以300U/Lα-干扰素组作用更强。结论:α-干扰素可以有效促进单核细胞源树突状细胞的功能成熟,并呈剂量依赖效应。

摘要：目的:构建大鼠心肌素(myocardin)慢病毒RNA干扰(RNAi)重组质粒,分析该RNAi质粒的干扰效果及其对血管平滑肌细胞(VSMCs)分化的影响。方法:设计并合成3对针对大鼠myocardin的shRNA片段,退火后将双链oligo-DNA克隆入慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP获得重组干扰质粒pGCSIL-GFP-shMyocd。以pEGFP-N1/X124G表达载体构建含Flag标签的myocardin表达质粒pEGFP-N1-Myocd。将重组干扰质粒和过表达质粒共转染293T细胞,Western blotting分析Flag标签蛋白的表达,筛选出干扰效率最好的干扰质粒并大量扩增。干扰质粒转染大鼠主动脉VSMCs,RT-PCR和Western blotting检测myocardin及分化标志物SM22α的表达。结果:成功构建大鼠myocardin的慢病毒干扰质粒pGCSIL-GFP-shMyocd和过表达质粒pEGFP-N1-Myocd。上述2种质粒共转染293T细胞后,1号干扰质粒转染组Flag标签蛋白表达下降最显著。将1号质粒进行大包装,获得滴度为1×10^(12)TU/L的慢病毒颗粒,该病毒转染VSMCs后,myocardin表达明显下调并伴随分化标志物SM22α表达的显著下降。结论:成功构建大鼠myocardin慢病毒重组干扰质粒pGCSIL-GFP-shMyocd;抑制基因myocardin表达后伴随VSMCs分化的表达下降,提示myocardin在VSMCs分化过程中的重要性。pGCSIL-GFP-shMyocd重组质粒的成功构建为后续研究特定病理条件下(如动脉粥样硬化)VSMCs表型转变的分子机制奠定了基础。

摘要：背景:骨髓间充质干细胞的分化与微环境密切相关,心肌梗死后,心肌细胞发生坏死,补体活化,自由基产生,分泌各种细胞因子,患者的血清成分也发生改变,这些改变究竟对骨髓间质干细胞向心肌细胞分化存在怎样的影响?目的:观察急性心肌梗死大鼠血清在体外对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的作用。设计、时间及地点:对比观察体外细胞学实验,于2005-09/2006-06在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成。材料:体质量50～80g三四周龄SD大鼠用于骨髓间质干细胞分离培养;体质量200～300g6～8周龄SD大鼠用于制作急性心肌梗死大鼠模型。方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。结扎左冠状动脉前降支制作急性心肌梗死大鼠模型,并抽取正常大鼠与模型大鼠血清备用。取第3代骨髓间充质干细胞分6组培养:未诱导组、5-氮胞苷诱导组、5-氮胞苷+心肌梗死模型大鼠血清诱导组、5-氮胞苷+正常大鼠血清诱导组、心肌梗死模型大鼠血清诱导组、正常大鼠血清诱导组。主要观察指标:大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后的形态学变化。大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后心肌肌钙蛋白的表达情况。大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后GATA-4和结蛋白mRNA表达水平。结果:大鼠骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷联合血清诱导后,部分细胞渐伸长、变细,胞体中央形成球形,二三周后可见细胞呈球形、棒状,邻近细胞之间形成连接,镜下可见部分分化的细胞呈节律性跳动,呈心肌样细胞改变,其心肌肌钙蛋白、GATA-4、结蛋白表达阳性。对照组和单纯血清诱导组骨髓间充质干细胞未见形态改变,其心肌肌钙蛋白为阴性,GATA-4、结蛋白呈弱阳性。结论:单纯使用心肌梗死大鼠血清不能诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,但心肌梗死血清能促进5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并促进分化的心肌细胞成熟。

摘要：背景:自体软骨细胞来源困难是束缚软骨细胞移植和软骨工程学发展的主要问题之一。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,在不同诱导条件下,骨髓间充质干细胞能分化形成多种组织细胞,如软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞及神经细胞等。胰岛素样生长因子-I是一种对肢体和软骨的形成及发育起重要调控作用的生长因子。目的:观察胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液是否能在体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。设计:开放性实验。单位:中山大学附属第二医院骨科和医学研究中心。材料:实验于2003-03/11在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。人骨髓间充质干细胞取自因健康原因需终止妊娠的4～6月龄水囊引产的胚胎。方法:采用Percoll分离液分离培养人胚骨髓间充质干细胞,体外扩增,用流式细胞仪测定骨髓间充质干细胞的CD44,CD71,CD34,CD45表达;在第4代骨髓间充质干细胞的培养基中加入100μg/L胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液,采用倒置显微镜观察、Ⅱ型胶原免疫组织化学、细胞内蛋白多糖含量测定等方法判断诱导细胞的形态变化和表达软骨基质的能力。主要观察指标:通过检测细胞CD34,CD44,CD45的表达,进行骨髓间充质干细胞表型鉴定。通过观测诱导后细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学及细胞分泌蛋白多糖能力的变化判断其是否向软骨细胞分化。结果:①倒置显微镜观察结果:体外培养的骨髓间充质干细胞呈现成纤维细胞形态。②骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定:流式细胞仪结果显示细胞均一性较好,第4代骨髓间充质干细胞阳性表达CD44,阴性表达CD34,CD45,说明分离获得的细胞符合骨髓间充质干细胞的特点。③光镜下观察骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞的形态变化:加入软骨细胞条件培养液和胰岛素样生长因子-I共培养,在培养过程中见骨髓间充质干细胞逐渐变圆,15d后可见部分细胞呈短梭形或多角形,突起短,呈现软骨细胞的特征。④Ⅱ型胶原免疫组织化学染色:胰岛素样生长因子组细胞在培养后第15天约72.5%的细胞可见棕黄色的颗粒分布于胞浆内,呈弱阳性或较强阳性。对照组骨髓间充质干细胞第15天的Ⅱ型胶原免疫组织化学为阴性。⑤蛋白多糖含量测定:胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液共培养组培养15d后,细胞内蛋白多糖含量为(8.92±0.91)μg/L,高于单纯骨髓间充质干细胞培养组[(2.56±0.26)μg/L,P<0.05],但低于软骨细胞组[(13.69±1.51)μg/L,P<0.05]。结论:胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液能诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。

摘要：目的探讨不同浓度氯胺酮对成人辅助性T淋巴细胞（Th细胞）分化的影响。方法择期手术患者20例，年龄20～60岁，ASA分级Ⅰ级，麻醉前从每位受试者肘静脉抽取血样20ml，分离外周血单个核细胞（PBMCs）。采用随机区组设计，将每份血样分离出的PBMCs随机分为3组（n=20）：氯胺酮不同终浓度组（K，组和K2组终浓度分别为2．5、25．0μg／ml），正常对照组（C组）加入等容量0．9％NaCl。24h后分别加入植物血凝素刺激，继续孵育48h后收集细胞。采用流式细胞小球微阵列术检测细胞培养上清液中IL-2、IL4、IL-6、IL-10、干扰素-γ（IFN-γ）和TNF-α的浓度；采用四色荧光流式细胞技术（CD3^＋CD8^-IFN-γ^＋标识Th1细胞，CD3^＋CD8^-IL-4^＋标识Th2细胞）测定Th1及Th2细胞亚群比例，并计算二者比值（Th1／Th2）。结果C组、K1组和K2组Th1及Th2细胞亚群比例、Th1／Th2、细胞培养上清液中IL-2、IL4、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的浓度差异无统计学意义（P〉0．05）。结论镇静浓度和麻醉浓度的氯胺酮在体外环境下对成人Th细胞分化无影响。

摘要：背景:糖皮质激素引起的髓内脂肪蓄积是由机体脂肪代谢异常在髓内形成的脂肪沉淀,还是由于激素直接作用于骨髓间充质细胞使细胞发生了分化,以及具体生成的过程目前还没有定论。目的:观察不同浓度地塞米松对骨髓间充质细胞成脂分化的影响。设计、时间及地点:观察性实验,于2007-01/2009-01在中国医科大学生物化学教研室完成。材料:3或4周龄SD大鼠80只,体质量(110±10)g,雌雄不拘。方法:分离培养大鼠骨髓间充质细胞,并进行传代,取第3代细胞作为实验标本。主要观察指标:①倒置显微镜下观察骨髓间充质细胞在地塞米松10-7mol/L浓度和正常培养状态下3,7,14,21d时的形态变化。②细胞碱性磷酸酶、SundanⅢ染色后骨髓间充质细胞的形态变化。③酚试剂法测定碱性磷酸酶活性。④四甲基偶氮唑盐法检测地塞米松对细胞增殖的影响。结果:①原代细胞接种24h后,培养瓶底即出现少许贴壁细胞,多呈纺锤形或梭形;随着培养时间延长,贴壁细胞明显增多,呈放射状排列。传代后细胞分布均匀,呈典型的成纤维细胞样。地塞米松刺激后,细胞由梭形变为多角形或不规则形,后期,随着浓度增大和作用时间延长,细胞团聚现象消失,很多贴壁的细胞悬浮、死亡。②在正常培养细胞中,没有或很少见到橘红色的脂肪颗粒着色,在含有地塞米松培养的细胞中,随着激素浓度增高和时间持续,细胞内SundanⅢ着色的脂肪颗粒明显增加。③在21d时,正常培养的细胞碱性磷酸酶活性值分别是10-8,10-7,10-6mol/L地塞米松组的1.57倍,4.49倍和5.0倍。在7,14,21d时,正常培养的细胞碱性磷酸酶分别是相应10-7mol/L地塞米松组的2.93倍,3.80倍和4.39倍,差异具有显著性意义(P<0.05)。④高浓度地塞米松对细胞增殖活力的抑制效果明显。10-7mol/L和10-6mol/L与其他各组相比,差异具有显著性意义(P<0.05)。结论:大剂量地塞米松促进骨髓间充质细胞的脂肪生成,抑制成骨分化,并且随着浓度增高和作用时间延长,作用加强。

摘要：背景:实验室前期研究表明黄芩苷可以提高体外培养的神经干细胞分化为神经元的比例。但考虑到体内实验中血脑屏障的存在,黄芩苷能否通过血脑屏障主要细胞成分而发挥诱导神经干细胞定向分化为神经元的能力还不清楚。目的:分别将大鼠脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞与神经干细胞共培养,观察在模拟体内复杂微环境条件下,黄芩苷能否定向诱导神经干细胞向神经元分化并促进分化神经元的成熟。设计、时间及地点:细胞水平的体外对照观察,于2007-09/2008-03在天津中医药大学中医药研究院中药药理学重点实验室和南开大学医学院完成。材料:取孕14dSD大鼠,用以分离培养神经干细胞。方法:利用Transwell装置,分别将脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经干细胞共培养。用含有10μmol/L黄芩苷的培养基作用7d,并设置空白对照组。以β-tubulinⅢ标记未成熟神经元,MAP-2标记成熟神经元,胶质纤维酸性蛋白标记星形胶质细胞。主要观察指标:应用细胞免疫荧光化学染色检测神经干细胞分化后β-tubulinⅢ、MAP-2和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞比例,以实时荧光定量反转录-聚合酶链反应技术检测黄芩苷对脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞血管内皮细胞生长因子、神经生长因子和血小板衍生生长因子mRNA表达的影响。结果:与脑微血管内皮细胞共培养条件下,与空白对照组比较,黄芩苷可显著增加β-tubulinⅢ阳性细胞比例(P0.05)。与脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞共培养条件下,与空白对照组比较,黄芩苷可显著增加MAP-2阳性细胞比例(P<0.01)。黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞48h,可以显著上调血小板衍生生长因子基因表达(P<0.01);作用72h可显著上调星形胶质细胞血管内皮细胞生长因子、神经生长因子和血小板衍生生长因子基因表达(P<0.01)。结论:黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞可诱导神经干细胞向神经元分化,黄芩苷同时作用于脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞可诱导神经干细胞向神经元定向分化并促进其成熟,可能与黄芩苷调控脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞生长因子分泌,改善微环境有关。