摘要：目的构建针对细胞周期素d1(cyclind1,由CCNd1基因编码)的shRNA表达载体,筛选出有效序列,观察其对肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法设计针对cyclind1基因编码区的3条寡核苷酸链,体外退火后克隆入干扰载体Pgenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和dNA序列测定。以脂质体法将空载体Pgenesil-1-K和3个重组质粒Pgenesil-1-CCNd11、Pgenesil-1-CCNd12、Pgenesil-1-CCNd13分别导人549肺腺癌细胞,48h后用Real time PCR和Western blotting技术检测各实验组肺腺癌细胞内cyclin d1 mRNA及蛋白的表达情况,用流式细胞仪检测细胞周期观察构建的载体对A549细胞增殖的影响。结果经酶切鉴定及dNA测序,重组质粒中已插入了目的基因片断。转染cyclin d1-shRNA的A549细胞48h后测定cyclin d1 mRNA和蛋白含量,以Pgenesil-1-CCNd13抑制cyclin d1 mRNA及蛋白表达效果最为有效,其抑制率分别为62%和60%,而且它能抑制A549细胞的增殖。结论成功构建了针对cyclin d1的RNA干扰表达载体Pgenesil-1-CCNd11、Pgenesil-1-CCNd12、Pgenesil-1-CCNd13,Pgenesil-1-CCNd13能有效抑制cyclin d1在A549细胞中的表达,并抑制A549的增殖,为进一步应用于肺腺癌的治疗实验研究奠定了基础.

摘要：背景:氧化型低密度脂蛋白可通过Ras/Raf/丝裂原活化蛋白激酶激酶/丝裂原活化蛋白激酶途径诱导血管平滑肌细胞增殖及细胞周期蛋白的表达。目的:观察胞外信号调节激酶是否参与了氧化型低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞周期推进以及周期素d1的表达。设计、时间及地点:对照观察细胞学实验,于2008-02/10在广州医学院完成。材料:人血浆低密度脂蛋白来自健康志愿者血清。Sd大鼠由广州医学院实验动物中心提供。方法:采用超速离心法分离人低密度脂蛋白进行氧化修饰及鉴定。以酶消化法培养大鼠血管平滑肌细胞,采用免疫组织化学染色法鉴定。主要观察指标:在静止的血管平滑肌细胞中加入MEK1/2选择性抑制剂10μmol/LPd98059和/或50mg/L氧化型低密度脂蛋白,以CCK-8和细胞计数法测定细胞增殖,流式细胞术观察细胞周期,蛋白印迹检测周期素d1蛋白表达及胞外信号调节激酶的活性。结果:CCK-8和细胞计数法显示,氧化型低密度脂蛋白能明显诱导血管平滑肌细胞增殖,Pd98059抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞增殖,并且呈时间依赖性。流式细胞术分析表明,经氧化型低密度脂蛋白处理24h后,血管平滑肌细胞从G0/G1期进入S期,S期细胞百分比明显增高(P<0.01),加入Pd98059处理24h后,血管平滑肌细胞由G0/G1期向S期的推进受到抑制。蛋白印迹结果显示,氧化型低密度脂蛋白能明显诱导周期素d1蛋白表达及胞外信号调节激酶的磷酸化,Pd98059抑制氧化型低密度脂蛋所诱导的周期素d1蛋白表达以及胞外信号调节激酶的磷酸化。结论:氧化型低密度脂蛋白能诱导血管平滑肌细胞增殖,促进细胞由G0/G1期向S期转换以及周期素d1表达,其作用部分是由胞外信号调节激酶所介导。

摘要：背景:国内外多年的研究表明稀土化合物在体内、外均具有明显的抑瘤性能。目的:观察三氯化镧对大鼠肝癌细胞细胞周期素d1和周期素依赖性激酶4蛋白表达的影响。设计:对照观察。单位:吉林大学第一临床医院肾病科。材料:实验于2002-06/2003-07吉林大学基础医学院组织胚胎教研室细胞培养室完成。CBRH-7919细胞按三氯化镧剂量不同分为4组,即空白对照组,0.01,0.1,1.0mmol/L三氯化镧组,每组分别培养1,3,5d,每组细胞各接种6复孔。方法:以体外培养大鼠肝癌细胞株CBRH-7919为研究对象,给予0.01,0.1,1.0mmol/L三氯化镧,培养后1,3,5d观察CBRH-7919细胞生长变化。①运用流式细胞术计算各期细胞所占比例。②四甲基偶氮唑蓝实验测定各孔吸光度值(A值)。③免疫细胞化学检测与G1期调控有关的细胞周期素d1和周期素依赖性激酶4的变化情况。主要观察指标:CBRH-7919细胞在不同剂量和不同培养时间的细胞周期素d1和周期素依赖性激酶4的表达情况。结果:①三氯化镧对CBRH-7919细胞生长的作用:0.1,1.0mmol/L三氯化镧组培养后3,5d吸光度值低于空白对照组(3d分别为1.140±0.070,0.706±0.092,1.461±0.087;5d分别为1.888±0.020,0.625±0.037,2.544±0.032),差异有显著性意义(P<0.05,0.001)。②三氯化镧对CBRH-7919细胞G0/G1期百分率的影响:1.0mmol/L三氯化镧组培养后1,3,5dG0/G1期细胞百分率高于空白对照组[分别为(60.70±0.20)%,(39.49±0.67)%;(61.66±0.97)%,(45.56±1.00)%;(69.92±0.18)%,(49.24±0.27)%],差异有显著性意义(P<0.01,0.001);0.1mmol/L三氯化镧组培养后5dG0/G1期细胞百分率高于空白对照组[分别为(58.88±0.73)%,(49.24±0.27)%],差异有显著性意义(P<0.05)。③三氯化镧对CBRH-7919细胞细胞周期素d1和细胞周期素依赖性激酶4阳性表达的影响:0.1,1.0mmol/L三氯化镧组培养后1d细胞周期素d1和细胞周期素依赖性激酶4表达(A)明显低于空白对照组(分别为562±35,453±22,860±82;705±84,680±28,762±16),差异有显著性意义(P<0.05,0.01,0.001)。结论:三氯化镧可通过下调细胞周期素d1和周期素依赖性激酶4,使肿瘤细胞从G1期进入S期受阻,从而抑制CBRH-7919细胞的生长。

摘要：目的 利用PGE-1建立针对抑制cyclind1功能的siRNA 真核表达载体以及对肝癌HepG2细胞增殖和周期的影响.方法 针对cyclind1 mRNA序列设计合成4对寡核苷酸,退火后连接到PGE-1质粒中,PCR及测序鉴定.用脂质体将重组质粒转染到HepG2中,RT-PCR cyclind1 mRNA的表达,G418筛选后用RT-PCR和Westernblot技术分别检测cyclind1 mRNA和蛋白质水平;流式细胞仪测定细胞周期的变化;MTT法测定细胞的生长.结果 在设计的4条靶序列中有一序列重组成质粒后,可明显抑制cyclind1的表达;目的 序列表达载体转染HepG2细胞后,可以明显减少G2-M期细胞的比例,当HepG2细胞稳定转染针对cyclind1的干扰质粒后,mRNA和蛋白质的表达也明显降低;HepG2细胞cyclind1表达降低后,其生长也受到明显抑制.结论 成功构建针对siRNA-cyclind1真核质粒,在体外可成功抑制人肝癌HepG2细胞的增殖.

摘要：目的:通过构建抑制cyclin d1基因小发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统,为肿瘤基因治疗提供实验依据。方法:利用基因重组技术构建靶向cyclin d1RNA干扰(RNAi)表达质粒,双酶切鉴定电泳及测序分析构建的质粒是否成功;Western Blot分析转染前后K562细胞cyclin d1蛋白表达的变化。结果:体外合成的64个碱基成功插入到预计位点,并且与设计序列完全一致;Western Blot分析结果显示转染所构建的质粒能明显下调K562细胞cyclin d1基因表达。结论:质粒的成功构建为研究其抑制cyclin d1基因表达,发挥抗肿瘤效应以及与放、化疗联合的协同效应打下基础。