摘要：应用mfold程序对锤头状核酶(ribozyme,Rz)和大鼠细胞周期蛋白(cyclin)d1基因的二级结构进行分析,设计合成锤头状Rz基因,通过RT-PCR扩增获得大鼠细胞周期蛋白d1目的基因,将Rz基因和细胞周期蛋白d1基因分别克隆入载体pGEM-3Zf(+)中,体外转录Rz基因和靶基因并进行切割实验;将Rz基因与逆转录病毒载体pLXSN重组得到Rz真核表达载体pLXSN-Rz,将其转染入HSC-T6细胞,G418筛选出阳性细胞克隆,用RT-PCR检测细胞周期蛋白d1基因的表达。结果显示:针对目的基因的832位点设计合成了Rz832,成功获得Rz832基因、细胞周期蛋白d1mRNA的体外转录载体pGEM3Zf-Rz832和pGEM3Zf-cd1,经体外转录出Rz832(105nt)及细胞周期蛋白d1mRNA(1079nt)。体外切割实验证实Rz832能够特异性切割细胞周期蛋白d1mRNA,产生1014nt和65nt的切割产物,切割效率为80%。所构建的pLXSN-Rz832经酶切电泳、PCR鉴定显示,插入的Rz832序列大小约为57bp,与预期结果相同,经测序证实Rz832序列正确。转染pLXSN-Rz832的肝星状细胞(hepaticstellatecells,HSCs)细胞周期蛋白d1mRNA的表达受到明显抑制,仅为对照组的42.22%(t=-193.443,P<0.01),结果表明:Rz832能够在体外特异性切割细胞周期蛋白d1mRNA、并在HSC-T6细胞内有效抑制细胞周期蛋白d1基因的表达。

摘要：目的:探讨在食管癌细胞增殖过程中蛋白酶激活受体-2(PAR-2)影响细胞周期蛋白d1(Cyclind1)的机制。方法:方法:使用食管癌EC109细胞株,实验分为:空白对照组、PAR-2激动组(加入激动剂SLIGKV)、PAR-2反激动组(加入反激动剂VKGILS)、PAR-2 shRNA组(PAR-2shRNA成功转染)和MAPK抑制组(加入阻滞剂Pd98059);取对数生长期的细胞,以6×104 cells/ml的密度接种于培养瓶中,置于孵育箱中培养24 h后使用PBS清洗3次,更换为无血清的1640培养基培养24 h,之后各实验组按实验设计分别加入所需试剂,每组设置3个复孔,于孵育箱中继续培养24 h,采用RT-PCR法检测PAR-2、ERK1、Cyclind1的mRNA的表达水平;采用Western blot法检测PAR-2、ERK1、p-ERK1、Cyclind1的蛋白表达水平。结果:与空白对照组相比,PAR-2激动组PAR-2mRNA、ERK1 mRNA、和Cyclind1 mRN表达明显升高(P<0.05),PAR-2、p-ERK1和Cyclind1蛋白表达升高(P<0.05);PAR-2 shRNA组PAR-2mRNA、ERK1 mRNA和Cyclind1 mRNA表达降低(P<0.05),PAR-2、p-ERK1和Cyclind1蛋白表达降低(P<0.05);MAPK抑制组ERK1 mRNA和Cyclind1 mRNA表达明显降低(P<0.05),p-ERK1和Cyclind1表达降低(P<0.05)。结论:PAR-2可通过MAPK通路调节Cyclind1的表达从而促进食管癌细胞EC109的增殖。

摘要：目的:细胞周期蛋白是细胞周期调控的决定性因子,RNA干涉是一种高效特异的基因沉默技术,能诱使细胞表现出特定基因缺失表型。通过RNA干扰阻断细胞周期蛋白d1基因表达,观察瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和细胞周期的影响。方法:实验于2006-07/2007-05在南方医科大学基因工程研究所(BSL-2级)完成。①实验材料:小干扰性RNA设计采用软件是ambion公司的在线软件siRNA target finder,合成采用化学合成法,委托上海吉凯基因有限公司合成,再经过变性退火处理后得到双链小干扰性RNA;瘢痕疙瘩成纤维细胞标本取自南方医院整形外科瘢痕疙瘩患者(均获得患者或其家属同意)。②实验过程及分组:将瘢痕疙瘩成纤维细胞应用脂质体法将针对细胞周期蛋白d1基因的小干扰RNA分子转染为实验组,细胞用等量脂质体处理为脂质体组,未处理组作为对照。③实验评估:于转染后24,48,72h,光学显微镜观察细胞形态变化;流式细胞术分析细胞周期;MTT法检测成纤维细胞的活性并绘制细胞生长曲线。结果:①转染特异性小干扰RNA后,细胞形态发生了异常改变,细胞由正常的长梭形变为圆形或椭圆形,提示可能是凋亡或坏死细胞。②转染后细胞周期G1期延长,S期缩短。转染特异性小干扰RNA24,48,72h后G1期细胞高于未处理组(依次为60.13%,66.22%,67.53%,54.53%);S期细胞低于未处理组(依次为18.25%,17.11%,11.15%,22.31%),表明细胞阻滞在G1期,进入S期细胞减少。③小干扰RNA-细胞周期蛋白d1转染后MTT法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞增值明显受到抑制,细胞生长曲线图表明,转染特异性小干扰RNA组细胞生长明显减缓。结论:特异性小干扰RNA分子能够抑制细胞周期蛋白d1基因的表达,使细胞阻滞于G1期,并诱导细胞凋亡。

摘要：背景:脑缺血再灌注后细胞周期蛋白的表达以其在凋亡机制中的作用为主,部分细胞凋亡是由于细胞增殖周期的异常调控所致。目的:研究脑缺血再灌注后细胞周期蛋白d1(cyclind1)和周期蛋白依赖性蛋白激酶4(cyclindependentkinase,CdK4)基因表达及其与神经细胞凋亡的关系。设计:随机对照的实验研究。地点和材料:本实验在青岛大学医学院脑血管病研究所和山东省脑血管病防治重点实验室完成。成年健康雌性Sd大鼠36只,体质量230～270g,清洁级,由中国科学院上海实验动物中心提供。将动物随机分为假手术组4只和实验组32只,实验组再进一步分为缺血1.5h再灌注2,6,12h,1,2,3,7和14d亚组,每组4只。方法:全部实验均由本文作者完成。具体方法:应用线栓法经左侧颈外-内动脉插线建立Sd大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型,原位末端标记法检测脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的变化,原位杂交技术检测cyclind1mRNA和CdK4mRNA的表达。结果:脑缺血再灌注2h脑组织即开始出现凋亡神经细胞,并于1d和2d分别在皮质区和纹状体区达高峰(分别为72.80±4.66和96.75±4.37)。神经细胞cyclind1mRNA和CdK4mRNA的表达分别于再灌注2h和6h开始逐渐增强,并于12h和1d分别在皮质区和纹状体区达高峰(皮质区分别为94.50±2.75和85.75±3.73,纹状体区分别为88.25?

摘要：目的研究Kaiso对cyclin d1转录抑制作用,探讨Kaiso抑制肺癌细胞增殖的分子机制。方法MTT和流式细胞仪检测A549和H1299两种肺腺癌细胞增殖和周期改变;Western blot和RT-PCR检测cyclin d1表达改变;生物信息学方法预测并设计cyclin d1启动子区Kaiso结合位点(KBS)的引物探针,ChIP证实Kaiso与cyclind1启动子区结合。结果 Kaiso能够直接结合cyclin d1启动子区KBS,抑制cyclind1转录,导致细胞增殖下降,G/G期比例升高,S期比例下降。结论 Kaiso通过下调cyclin d1转录抑制肿瘤细胞增殖和周期进程。

摘要：目的通过RNA干扰(RNAi)技术,观察肿瘤转移相关基因1(MTA1)对裸鼠喉鳞癌移植瘤生长和转移能力的影响。方法设计MTA1的短发夹RNA(shRNA)慢病毒干扰载体,进行包装与转染Hep-2细胞。将无关shRNA对照组和MTA1shRNA感染的Hep-2细胞接种于裸鼠爪垫,每组5只。复制人喉癌移植瘤淋巴转移模型,9周后处死裸鼠,取下肿瘤组织及腹股沟淋巴结,进行HE染色形态学观察,反转录PCR检测MTA1、β联蛋白(β-catenin)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、细胞周期蛋白d1(cyclin d1)mRNA的水平,Western blot法检测MTA1、β-catenin、MMP-9、cyclin d1蛋白水平。结果慢病毒MTA1干扰载体筛选成功;2组人喉癌裸鼠爪垫移植瘤100%成瘤;MTA1 shRNA转染细胞裸鼠肿瘤体积在同一时间点均明显小于无关shRNA对照组;MTA1 shRNA转染细胞5只裸鼠爪垫肿瘤未发现淋巴结转移;无关shRNA对照组5只裸鼠腹股沟淋巴结切片均可见喉癌细胞;与无关shRNA对照组相比,MTA1 shRNA转染细胞MTA1、β-catenin、MMP-9、cyclin d1的mRNA和蛋白水平明显降低。结论抑制MTA1基因能够减缓裸鼠喉鳞癌的生长并降低其转移能力。

摘要：目的 探讨RNA干扰阻断细胞周期蛋白d1（Cyclind1）基因表达后，对瘢痕疙瘩成纤维细胞细胞周期和细胞增殖、凋亡的影响。方法针对Cyclind1基因设计并合成特定的小分子干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）转染人瘢痕疙瘩成纤维细胞，测定Cyclin d1mRNA水平，流式细胞术分析细胞周期，F1TC-Annexin V／PI细胞平均百分率为凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况，dNA梯型观察凋亡细胞dNA变化。结果特异性siRNA能在mRNA水平下调成纤维细胞的Cyclin d1基因的表达，转染特异性siRNA24、48、72h后，G1期细胞平均百分率分别为（59．80±3．06）％、（66．01±4．03）％和（67．43±5．35）％，高于对照组（54．50±5．35）％；S期细胞平均百分率为（18．40±1．42）％、（17．21±1．76）％和（11．07±1．00）％，低于对照组（22．33±1．49）％。细胞凋亡率分别为（7．82±0．45）％、（15．71±1．06）％、（18．32±1．08）％，均显著高于对照组（0．68±0．12）％，细胞dNA断裂成片段状。结论特异性siRNA分子能够抑制细胞Cvclind1基因的表达，使细胞阻滞于G1期，并诱导细胞凋亡，为应用RNA干扰技术治疗瘢痕疙瘩提供了初步实验依据。

摘要：目的证实Cyclin d1基因作为肿瘤基因治疗新靶点的可行性及发卡环RNA(shRNA)表达载体介导该基因沉默的有效性。方法设计合成Cyclin d1-shRNA模板片段,与Pgenesil-1-U6载体连接,构建shRNA真核表达载体;将Pgenesil-Cyclin d1-shRNA转入ACHN肾癌细胞株。RT-PCR、Western blot分析Cyclin d1基因mRNA及蛋白表达;MTT比色法绘制细胞生长曲线;流式细胞术测细胞凋亡率;Transwell小室体外侵袭实验检测细胞侵袭。结果Pgene-sil-Cyclin d1-shRNA构建成功。Cyclin d1-shRNA实验组Cyclin d1mRNA抑制效果显著(0.10&#177;0.04),明显高于Pgenesil-NC阴性对照组(0.92&#177;0.03)及ACHN空白对照组(0.94&#177;0.04)(均P<0.05)。同样,实验组Cyclin d1蛋白表达明显下调。流式细胞术分析提示,Cyclin d1-shRNA组细胞早期及晚期凋亡细胞均较Pgenesil-NC组和ACHN组显著增高。生长曲线显示Cyclin d1-shRNA组细胞生长明显缓慢(P<0.05)。Transwell实验同样发现该组细胞侵袭能力显著下降(P<0.05)。结论Cyclin d1可作为肾癌ACHN细胞生物学行为的评判标准。经载体介导shRNA干扰的高效性为肾癌基因治疗提供了实验依据。

摘要：胰岛素(Insulin)通过细胞周期蛋白d1(Cyclin d1)调节糖代谢的物理机制,一直缺乏系统完整的理解.基于Hill动力学与Michaelis-Menten方程,建立理论模型研究Cyclin d1介导的Insulin对糖代谢的调节作用,研究发现,Insulin通过刺激AKT抑制GSK3,促进Cyclin d1表达提升.形成的Cyclin d1-CdK4复合物,改变组蛋白乙酰转移酶(GCN 5)的活性及磷酸化水平,实现对糖代谢重要参与酶PCK1的抑制调节,进而调控糖转化代谢.理论结果符合实验,进一步系统完整地揭示了Cyclin d1介导的Insulin对糖代谢调节的调控机理,确认了Cyclin d1对糖代谢的调控作用,可为设计阻断Cyclin d1异常导致的病变治疗方案提供理论依据.

摘要：目的 cyclin d1基因在细胞周期调控中起关键性作用.研究表明其过表达与肿瘤的发生、发展及预后密切相关;并且与肿瘤细胞对化疗药物的抗拒性有关.抑制cyclin d1蛋白表达可达到化疗增敏作用.研究目的在于利用RNA干扰(RNAi)技术体外观测其对K562细胞cyclin d1基因的沉默效应及其增强多柔比星(AdM)对K562细胞毒性的作用.方法 体外构建靶向cyclin d1基因的小发夹RNA(shRNA)表达质粒,通过壳聚糖介导转染K562细胞,Western Blotting分析检测转染前后cyclin d1蛋白表达变化,流式细胞术检测细胞周期分布及对凋亡率的影响,MTF法检测K562细胞对AdM敏感性的变化.结果 构建了靶向cyclin d1基因的shRNA表达质粒(pshRNA-419和pshRNA-575)经壳聚糖转染后,能显著抑制cyclin d1基因表达;影响K562细胞周期分布,诱导细胞凋亡.并降低AdM半数抑制浓度,提高了化疗敏感性.而设计一碱基突变的序列所构建的质粒并无上述生物学效应.结论 沉默K562细胞cyclin d1基因表达可达到有效的化疗增敏目的.