摘要：采用独立设计的反复冻融方法,去除兔颈总动脉中的血管细胞,对所获得的细胞外基质进行组织、生化、力学等分析。在分离兔颈总动脉后,首先用低渗缓冲液处理,然后经低温反复冻融,最后用非离子型去污剂处理。所得的支架行组织染色和扫描电镜分析,显示基质的微观结构;荧光染色和基因组DNAPCR分析,检测细胞DNA残留;分别行羟脯氨酸定量分析和轴向拉伸强度分析,检测胶原蛋白和血管生物力学性能的变化;支架没有明显的细胞毒性,溶血率低于医用材料的标准;支架随时间缓慢降解。种植兔的骨髓干细胞,研究细胞在支架上的粘附生长能力。应用本方法能彻底去除血管细胞,没有细胞碎片和DNA的残留,并保留了较完整的细胞外基质和力学性能,具有开放的大孔径结构,细胞生物相容性好,是一种理想的组织工程血管支架材料。

摘要：目的　动态观察准分子激光屈光性角膜切削术 (photorefractivekeratectomy,PRK)后角膜组织细胞外基质 (extracellularmatrix ,ECM)成分的变化 ,并探讨其与角膜雾状混浊 (haze)的关系。方法2 4只兔按术后即刻、2 4h、1周、2周、1个月、3个月、6个月及 12个月不同处死时间分为 8个实验组 ,每组 3只 ,按设计矫正度数 - 10 0 0D行右眼PRK术 ,术后裂隙灯显微镜检查各组角膜的haze分级 ,并取角膜组织以免疫组织化学方法检测ECM成分 ,包括Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、Ⅵ型胶原蛋白、细胞纤维连接蛋白 (cellularfibronectin ,cFN)、细胞黏合素 (tenascin ,TN)及层黏连蛋白 (laminin ,LN)。结果　PRK术后haze的发生率为 10 0 % ;角膜基质浅层内沉积新合成的Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ型胶原蛋白及cFN、TN、LN等ECM成分 ,其表达量变化与haze分级变化基本一致。

摘要：背景:作为每个组织和器官中的细胞分泌产物,细胞外基质凭借其独一无二的生物学特性成为了临床应用中一种独特的再生型生物材料。糖胺聚糖作为细胞外基质中的重要活性物质之一,具有诸多优良的生物学特性。目的:整理总结近年来国内外对细胞外基质中糖胺聚糖检测方法的研究进展,并对各方法进行了对比,为优化细胞外基质糖胺聚糖检测方法提供帮助和方法参考。方法:通过输入关键词“糖胺聚糖检测、细胞外基质、determination methods of glycosaminoglycan、Animal-derived extracellular matrix”,从PubMed、知网等文献搜索引擎共搜索出2 037篇相关文献,筛选并整理63篇文献,总结出常见的糖胺聚糖检测方法。根据阅读文献时总结的思路,提出基于现有提取检测糖胺聚糖方法的改进方案,并设计对比实验验证。结果与结论:糖胺聚糖对动物源细胞外基质生物学性能起着至关重要的作用,可赋予细胞外基质材料及产品优异的生物活性与促修复功能。检测材料中糖胺聚糖含量可指导细胞外基质材料的工艺优化,因此糖胺聚糖检测方法至关重要。目前糖胺聚糖的检测方法主要有高效液相色谱法、糖醛酸分析法、乙醣胺定量分析法与二甲基亚甲基蓝检测法,以上方法均存在一定的局限性。基于已有的研究成果,针对二甲基亚甲基蓝检测法中的样本消化、糖胺聚糖提取等步骤做了改进,大幅度提升了检测结果的准确度,为其他糖胺聚糖检测方法提供了思路和参考。

摘要：目的研究沉默血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)基因对于亚溶解型(sublytic)C5b-9复合物诱导大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)分泌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的影响。方法设计合成针对TSP-1基因4个靶点的小发夹RNA(small hair RNA,shRNA),并构建相应的表达质粒,筛选沉默效率最佳的TSP-1shRNA(shTSP-1)后,将shTSP-1转染体外培养的大鼠GMC,再给予sublytic C5b-9刺激。以Westernblot检查TSP-1、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)及Ⅳ型胶原蛋白(collagenⅣ)的表达情况。另用ELISA法测定培养上清中总转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和活化TGF-β1的含量。结果核酸序列分析证明,4种TSP-1shRNA重组质粒均构建成功。Western blot实验证实,构建的shTSP-1-3(Thbs1-3)具有最佳的沉默效率。将shTSP-1-3转染大鼠GMC后,在沉默TSP-1基因表达的同时,能明显抑制由sublytic C5b-9诱导的TGF-β1活化及细胞外基质(FN和collagenⅣ)的合成。结论 TSP-1基因表达在sublytic C5b-9刺激大鼠GMC诱导TGF-β1活化及ECM分泌的过程中,发挥了重要的促进作用。

摘要：目的　探讨输尿管细胞外基质 (ECM )的制备方法。方法　采用正交设计方法 [L9( 34 ) ]。取 19只兔的输尿管 19条 ,其中 9条被分成 2 7段 ,按正交设计随机分为 9组行脱细胞处理。所有试验重复 3次。经脱细胞处理后 ,采用苏木素 伊红 (HE)染色及计算机图像分析对基质进行残余细胞成分计数 ,统计分析获得最佳方法 (A3B2 C3)。另 10条输尿管采用最佳方法制备成输尿管ECM并用于输尿管缺损修复实验 ,分别于修复术后 1、4及 16周取材分析缺损修复处组织再生情况。结果　各组脱细胞后残余细胞成分量均不相同 ,但第 7、9组均未发现细胞残余成分 ;采用最佳方案制备的输尿管ECM经扫描电镜分析未发现细胞残片。缺损修复实验后 1周移行上皮组织爬满基质内表面 ;术后 4周可见基质内细胞成分明显增多 ,但较正常组织稀疏 ,排列不规则 ;16周 ,取材的组织学分析表明细胞外基质替代部分组织再生状况良好。结论　制备输尿管细胞外基质的最佳方案是A3B2 C3,即在输尿管脱细胞处理过程中采用 0 .4%胰蛋白酶、1.0 %甲醛 + 0 .2 %戊二醛、40U/mlDNase。

摘要：目的　探讨尿道细胞外基质 (ECM )的制备方法。　方法　采用 4因素 3水平 ,9次实验的正交设计 [L9(34) ]。切取 37只兔的尿道 ,2 7条按正交设计随机分为 9组行尿道脱细胞处理 ,试验重复 3次。采用HE染色及计算机图像分析对尿道基质进行残余细胞成分计数 ,统计分析获得最佳方法 :0 .4 %胰蛋白酶、1%甲醛加 0 .2 %戊二醛、4 0U/mlDNA酶 (A3 B2 C3 方案 )。另 10条兔尿道制备成尿道ECM并用于同种异体尿道缺损修复实验 ;分别于修复术后 10d ,3、6及 2 4周取材观察缺损修复处组织再生情况。　结果　各组脱细胞后残余细胞成分量均不相同 ,第 7、9组未发现细胞残余成分 ;制备的尿道ECM经扫描电镜分析未发现细胞残片。缺损修复实验术后 10d ,基质中见单层上皮细胞 ,且有血管长入ECM中 ,但管径较小 ,基质和受体尿道连接处有炎性细胞浸润 ;3周时尿道ECM管腔已完全被上皮细胞覆盖 ;6周时可见平滑肌细胞再生 ,炎性细胞消失。 2 4周后基本结构近似正常。　结论　制备尿道细胞外基质中 3个关键条件的最佳水平为A3 B2 C3 ,即在尿道脱细胞处理过程中采用 0 .4 %胰蛋白酶、1%甲醛加 0 .2 %戊二醛、4 0U/mlDNA酶。

摘要：目的:利用pEGFP质粒载体构建介导结缔组织生长因子(CTGF)短发夹RNA表达的质粒,筛选有效的抑制序列后,研究其对HSC-T6中TGF-β1、CTGF及细胞外基质表达的影响。方法:1.分别设计3对针对CTGF的有小发夹结构的两条DNA序列及1对非特异对照序列,构建重组体成功后转染HSC-T6,24h后通过RT-PCR及Western blotting分析HSC-T6 CTGFmRNA及蛋白表达水平,筛选出有效抑制CTGF表达的序列。2.将已构建并筛选出有最高抑制效率的pEGFP-CTGFshRNA转染HSC-T6,培养24、48h后用RT-PCR和/或Westernblotting检测各组细胞中TGF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因的表达;放免法分析细胞上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量。结果:将构建成功的3组pEGFP-CTGFshRNA转染肝星状细胞后,筛选出两组能高效抑制CTGF表达的序列;pEGFP-CTGFshRNA能明显抑制HSC-T6CTGF、Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA及蛋白的表达,降低上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量(P<0.01或P<0.05),而对TGF-β1的基因表达则无影响。结论:pEGFP-CTGFshRNA能高效抑制肝星状细胞中CTGF及细胞外基质的表达;CTG-FshRNA介导的RNA干扰有望对慢性肝病所致肝纤维化具有治疗潜力。

摘要：目的 探讨脱细胞胆管细胞外基质（ECM）的制备方法及其替代胆总管缺损的可行性。方法 采用4因素3水平9次实验的正交设计[L9（3^4）]，切取活体犬的肝外胆管39段，每段长1cm，其中27段按正交设计随机分为9组行脱细胞处理，试验重复3次。采用苏木素．伊红（HE）染色及计算机图像分析对ECM进行残余细胞成分计数，进行极差分析及方差分析，获得制备ECM的最佳方案。另12段胆管按最佳方案制备成ECM并用于同种异体胆总管缺损修复实验。分别于术后2、4、12及24周取材观察缺损修复处组织再生情况。结果脱细胞后第7、9组未发现残余细胞，ECM富含胶原，第9组胶原呈立体交叉交联。移植术后2周，ECM内膜面见少量单层上皮细胞，有血管长入其中，ECM中有少量成纤维和平滑肌细胞，吻合口处有较多炎性细胞浸润；4周ECM管腔被上皮细胞覆盖，排列整齐，ECM中有较多成纤维和少量平滑肌细胞，吻合口有少量炎性细胞浸润；12周吻合痕迹消失，ECM中有较多成纤维、平滑肌细胞和少量纤维细胞；24周ECM中有以平滑肌细胞和纤维细胞为主，少量成纤维细胞，结构近似正常。结论制备ECM中3个关键条件的最佳水平为A383C3，即在胆管脱细胞处理过程中采用0．4％胰蛋白酶、1．0％叠氮二苯基磷（DPPA）、40U／ml DNA酶。所得ECM应用于犬同种异体胆总管端端吻合修补，效果满意。

摘要：背景:去细胞处理的猪主动脉瓣膜植入人体后发生了免疫排斥反应,分析引起免疫排斥反应的原因是由于猪瓣膜的细胞外基质与宿主发生接触引起了免疫激活。目的:试图将人自身的细胞外基质履盖去细胞猪瓣膜表面起到隔离猪瓣膜与宿主血液成分接触的作用。同时应用免疫组化的方法验证人细胞外基质覆盖瓣膜的效果。设计、时间及地点:观察性实验,于2008-08/2009-04在解放军第二军医大学长海医院胸心外科实验室完成。材料:新鲜猪心脏瓣膜取自上海五丰上食肉联厂,采用酶消化法将猪主动脉瓣叶行脱细胞处理。密度梯度离心法从健康志愿者骨髓中获取骨髓基质干细胞。方法:用人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架来构建组织工程瓣膜,再应用前期制备的抗人细胞外基质单克隆抗体,采用免疫组织化学染色鉴定人细胞外基质在体外构建的组织工程瓣膜上的黏附情况。以未构建的去细胞猪瓣叶为对照组。主要观察指标:①组织工程瓣膜上种子细胞的黏附和生长情况。②免疫组织化学法检测人细胞外基质在瓣膜上覆盖的效果。结果:光镜下观察瓣膜表面均形成了细胞层。扫描电镜所见细胞排列欠规则,未完全覆盖去细胞瓣叶表面,可见裸露的瓣膜支架。免疫组织化学方法检测构建的瓣膜表面呈阳性反应证明有人的细胞外基质黏附,而对照组呈阴性证明了检测方法具有特异性。结论:体外构建的组织工程瓣膜上检测到有人的细胞外基质黏附。

摘要：背景:血管壁细胞包括内皮细胞和平滑肌细胞,平滑肌细胞合成分泌的胶原蛋白、弹力蛋白和蛋白聚糖等细胞外基质是提供血管塑形及张力的最主要成分,平滑肌细胞在细胞外基质支架上生长可能更接近体内生长环境特性。目的:观察鼠骨髓来源平滑肌祖细胞在毯状细胞外基质支架上的生长特性。设计、时间及地点:细胞水平对比观察实验,于2007-07/2008-07在江苏大学临床检验实验室完成。材料:将纤维蛋白原、层粘连蛋白和纤粘连蛋白按一定比例混合后,在新鲜大鼠血浆促凝coagulation作用下,构建毯状细胞外基质支架。方法:实验组诱导培养骨髓来源的第2代平滑肌祖细胞种植在毯状细胞外基质支架表面。对照组将骨髓来源的第2代平滑肌祖细胞接种到无菌圆盖玻片上。主要观察指标:于培养1,4,7,10,14,21d用电镜观察支架表面结构及平滑肌祖细胞生长情况;WesternBlotting法、Real-TimePCR法分别检测α-SMA蛋白及mRNA表达变化。结果:实验组平滑肌祖细胞贴壁率、增殖数明显高于对照组(P<0.01);电镜显示细胞在支架表面形成较平整的平面,如典型"平滑肌"形状;实验组平滑肌祖细胞为多层、三维立体、更接近天然血管的结构;实验组α-SMA蛋白及基因表达明显高于对照组(P<0.05)。结论:细胞外基质支架能显著促进平滑肌祖细胞黏附、增殖和分化,可作为一种新颖的合成人造血管的生物组织工程支架。