摘要：背景:脊髓损伤高发且后果严重,至今尚无有效措施挽救丧失的神经功能。哺乳动物嗅觉系统的一类特殊胶质细胞的移植引起关注。目的:观察人胚嗅鞘细胞和大鼠胚胎脊髓共同移植在促进大鼠横断脊髓轴索再生方面是否产生协同作用。设计:开放性实验。单位:无锡第三人民医院细胞室,苏州大学附属第一医院神经外科,东南大学附属中大医院神经外科。材料:实验于2002-09/2004-10在无锡市第三人民医院细胞实验室完成。①选取清洁级成年雌性SD大鼠36只,随机数字表法分成4组:人胚嗅鞘细胞组10只、鼠胚胎脊髓组10只、联合移植组10只,模型组6只。②取12周左右的流产新鲜人胚胎(产妇知情同意)用于嗅鞘细胞的培养纯化。③取孕14d的SD大鼠1只,施行剖腹手术将胎鼠连同胎膜一同取出,用于新鲜胚胎脊髓的制备。方法:①4组大鼠均建立脊髓半切洞模型。模型组在损伤洞腔内填塞明胶海绵加全培养基8μL,在损伤上下各1mm处注射相同培养基2μL;人胚嗅鞘细胞组明胶上给予嗅鞘细胞悬液8μL,损伤上下各1mm处注射细胞悬液2μL;鼠胚胎脊髓组将组织碎块直接填塞在洞腔内,外覆明胶;联合移植组将同样大小的胚胎脊髓填塞在洞腔内,然后用微量加样器将8μL的嗅鞘细胞悬液注入洞腔,外覆明胶,在洞腔上下各1mm处注射细胞悬液2μL,按层缝合肌层皮肤。②定期对各组大鼠进行行为学评定,结合病理学观察,并通过辣根过氧化物酶-四甲基联苯胺逆行示踪技术,评价嗅鞘细胞和胚胎脊髓对神经元存活、纤维再生的影响。主要观察指标:①人胚嗅鞘细胞体外培养及纯化。②体外免疫细胞化学分析。③大鼠后肢运动功能BBB评分测定结果。④移植物及受损脊髓修复的免疫组化检测结果。⑤辣根过氧化物酶-四甲基联苯胺示踪对各组被标记的皮质及中脑红核神经元的定量分析情况。结果:①人胚嗅鞘细胞大部分呈双极纺锤型,培养5～7d左右,细胞相互交织成网状,可见大量细胞分裂相。纯化后的细胞纯度为85%。②P75阳性细胞率为(83±7)%,大约(81±6)%的细胞呈胶质纤维酸性蛋白阳性,(91±9)%的细胞呈Vimentin阳性,Nestin阳性率为(77±5)%。③术后3～5d,模型组伤肢开始挛缩,正常侧下肢活动稍受限,其余3组少见明显挛缩症状。从术后2周开始,各组动物行为功能的恢复幅度明显增快,联合移植组BBB评分明显高于人胚嗅鞘细胞组、鼠胚胎脊髓组、模型组[(6.2±1.13),(5.0±1.15),(3.9±0.88),(3.3±1.03)分,P<0.05]。④人胚嗅鞘细胞组、联合移植组均在移植部位及移植区2.0～5.0mm范围内见到P75及胶质纤维酸性蛋白阳性双极或多极细胞,同时多极细胞中发现碱性蛋白(+)颗粒。鼠胚胎脊髓组、联合移植组脊髓缺损灶内存在大量MAP2阳性反应的细小神经元。人胚嗅鞘细胞组、鼠胚胎脊髓组、联合移植组在脊髓缺损区内都不同程度观察到神经丝阳性纤维存在,尤以联合移植组最为明显,模型组未能找到神经丝阳性纤维存在。⑤模型组损伤侧神经元基本无辣根过氧化物酶标记,而联合移植组标记的皮质、中脑红核神经元的数量均显著高于人胚嗅鞘细胞组、鼠胚胎脊髓组(P<0.05)。结论:嗅鞘细胞和胚胎脊髓联合移植对损伤脊髓具有明显保护作用且促进宿主脊髓轴突再生,在加快大鼠的功能恢复中起到了互补和协同的作用。

摘要：背景:常规药物治疗、介入或血管旁路移植手术对下肢动脉闭塞症的远期疗效均不理想。近年来采用干细胞的血管再生疗法在梗死部位修复或重新建立有效侧支循环逐渐成为可能。目的:验证骨髓间充质干细胞自体移植对兔缺血后肢血管再生的促进作用。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-08/2006-11在江苏省血吸寄生虫病防治研究所完成。材料:选用新西兰大白兔8只,制备兔后肢缺血模型。按随机数字表法分为2组,实验组及对照组各4只。方法:分离培养实验组兔骨髓间充质干细胞,5-溴-2-脱氧尿苷标记,将骨髓间充质干细胞制成悬液注射于实验组兔后肢缺血部位;对照组注射等量生理盐水。主要观察指标:2周后行兔股动脉二维及彩色多普勒超声检测,观察移植前后的血管内径、血流峰值速度及血流加速时间等;取缺血部位肌肉组织,通过免疫荧光及苏木精-伊红染色观察移植细胞分布及血管生成情况。结果:细胞移植2周后实验组兔的股动脉内径、血流峰值速度均大于对照组(P<0.01),血流加速时间短于对照组(P<0.01)。免疫荧光染色结果显示实验组兔移植部位有抗5-溴-2-脱氧尿苷染色阳性细胞存在;苏木精-伊红染色结果显示实验组缺血部位血管密度高于对照组。结论:骨髓间充质干细胞具有促进血管生成的作用,自体移植可望成为一种简单的、有效的治疗下肢缺血的方法。

摘要：背景:近年的研究表明,细胞移植可以修复受损的心肌组织,促进缺血区域新生血管的形成,改善缺血心肌的灌注和收缩功能。目的:观察自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植至犬心肌梗死模型后在体内的分化及对心功能的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-09/2008-04在天津泰达国际心血管病医院动物实验室完成。材料:成年杂种犬16只,体质量15～25kg,通过结扎冠状动脉前降支中段建立急性心肌梗死模型。方法:16只杂种犬投币法随机分为移植组(n=10)和对照组(n=6),移植组于心肌梗死后2h经冠状动脉内移植CM-DiI标记的骨髓单个核细胞;对照组注射等量生理盐水。冠状动脉结扎后2h及6周时行超声心动图检查,移植后6周处死所有动物于梗死区及其邻近部位取材。主要观察指标:①心肌梗死后6周两组心功能指标比较。②荧光显微镜下观察骨髓单个核细胞在心肌组织中的分化情况。③透射电镜观察移植组梗死区心肌组织的变化。结果:纳入杂种犬16只,全部存活。左前降支结扎2h后可见结扎点远端心肌组织变紫,室壁活动减弱,心电图出现ST段弓背样抬高。①对照组心肌梗死后6周和心肌梗死后2h相比各项指标均无显著改善(P>0.05)。移植组术后6周时左心室射血分数、左心室收缩期末内径及左心室短轴缩短率均较心肌梗死后2h有明显改善(P<0.01),其中左心室射血分数与对照组相比亦有明显改善(P<0.05),移植组射血分数较对照组提高7%左右。②荧光显微镜下可见移植组自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植后可分布于梗死区及梗死周边区,并表达肌球蛋白重链;正常心肌组织及对照组心肌组织内未见移植细胞。③透射电镜下可见移植组分化完全的血管内皮细胞及类心肌样细胞。结论:骨髓单个核细胞可在梗死区梗死周边区存活并逐渐分化成心肌样细胞,促进缺血心肌血管新生,改善心功能。

摘要：背景：基础研究表明，肝细胞移植可以改善急性肝功能衰竭动物的生化参数及提高生存率。但其广泛应用于临床之前，还有细胞来源和免疫排斥、移植肝细胞在受体中的分布、形态结构变化等方面的问题需要解决。目的：观察大鼠脾内移植SV40LT抗原基因转染肝细胞的早期组织形态学和超微结构特点。设计、时间及地点：随机对照动物实验，细胞病理学观察，于2001-03／12在卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成。材料：选用Wistar大鼠60只，制作脾内肝细胞移植模型。方法：将60只大鼠按随机数字表法分4组，每组15只。原代组、原代＋环孢素A组脾内注射原代肝细胞；SV40LT抗原基因组、SV40LT抗原基因＋环孢素A组脾内注射SV40TL抗原基因转染的肝细胞。移植前24h至术后14d，原代组、SV40LT抗原基因组每天经尾静脉注入0．5mL生理盐水：原代＋环孢素A组、SV40LT抗原基因＋环孢素A组每天经尾静脉注入环孢素A10mg／（kg·d）。主要观察指标：术后每天每组取1只大鼠，取脾脏行光镜及电镜检查，观察移植肝细胞的存活率、组织形态学和超微结构特点，共观察14d。结果：①与原代组、SV40LT抗原基因组比较，原代＋环孢素A组和SV40LT抗原基因＋环孢素A组移植肝细胞的组织形态学及超微结构改变较小，移植肝细胞的存活数增高（P〈0．05）。②SV40LT抗原基因＋环孢素A组、原代＋环孢素A组移植肝细胞的存活率在术后1～7d差异无显著性意义（P〉0．05）；术后8～14d，SV40LT抗原基因＋环孢素A组肝细胞存活率高于原代＋环孢素A组（P〈0．01）。结论：SV40LT抗原基因转染的肝细胞脾内移植后，在使用免疫抑制剂的情况下能长时间保持较高的存活细胞数，维持完整的组织形态学结构。

摘要：背景:CD4+CD25+调节性T细胞是维持机体免疫耐受的重要调控者,参与了多种移植免疫耐受的诱导。目的:拟观察小鼠睾丸内胰岛移植后CD4+CD25+调节性T细胞分布的特点。设计、时间及地点:观察对照动物实验,2007-04/2008-01在江西省实验动物中心完成。材料:成年Balb/c小鼠。方法:分离小鼠胰岛细胞,采用胰管内注射胶原酶水浴消化及Ficoll400不连续密度梯度离心法纯化,以双硫腙染色,计算胰岛细胞纯度,以体外葡萄糖刺激胰岛素分泌试验判定胰岛细胞功能。将胰岛移植至小鼠睾丸或肾包膜下,每只移植300～400个胰岛。在胰岛移植24h后麻醉处死小鼠,取脾脏、睾丸及淋巴结,制成细胞悬液,免疫磁珠法分离CD4+CD25+T细胞,通过流式细胞仪分析计数。主要观察指标:胰岛细胞的纯度及功能,CD4+CD25+调节性T细胞的分布。结果:纯化后每只胰腺获得(478±53)个胰岛细胞,纯度为(81.5±12.3)%,纯化后细胞形态完好,活度大于90%。睾丸内胰岛移植时,睾丸、淋巴结及脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞均显著增多(P<0.05～0.01)。结论:睾丸内胰岛移植能明显上调睾丸、淋巴结及脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞数量。

摘要：背景:脐血单个核细胞可作为种子细胞源以移植修复不同原因所致脑功能损害,但能否表达神经元另一重要特有分子τ蛋白?目的:探讨脐血单个核细胞在培养前后及细胞因子诱导作用下,τ蛋白mRNA的表达。设计:随机对照研究。地点和对象:实验地点:华中科技大学同济医学院。采集健康新生儿脐血8份,每份80mL。干预:在细胞培养过程中,使用细胞因子:表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)。主要观察指标:①细胞形态。②τ蛋白mRNA在脐血单个核细胞中的表达。结果:培养前,脐血单个核细胞胞体小呈圆形,培养后EGF+bFGF组细胞胞体较大,有粗长突起形成,未加细胞因子所培养细胞胞体较小,突起较短、较细,形似星形细胞。反转录聚合酶链式反应(reverse-transcriptpolymerasechainreaction,RT-PCR)检测未培养的脐血单个核细胞τ蛋白mRNA呈阴性而MAP2mRNA表达阳性,培养后二者均表达阳性,在EGF+bFGF作用下,阳性表达更明显。结论:脐血单个核细胞表达MAP2mRNA,经培养后同时表达τ蛋白mRNA,细胞因子能增强这种作用。

摘要：完全性房室传导阻滞是各种心脏病的重要并发症,生物心脏起搏是近年来其治疗研究的热点。本文通过分析目前生物起搏的临床应用所面临的瓶颈和问题,结合笔者的研究实践,就再建心脏房室传导通路这一课题提出如下思考:(1)组织工程化心传导束(ECT)是生物起搏治疗房室传导阻滞策略中一种较为理想的方式;(2)非基因改造成体干细胞诱导为起搏细胞或传导细胞,能够使生物起搏和ECT治疗房室传导阻滞的临床推广应用变得容易;(3)采用ECT实现生理性房室传导及临床应用,必须对其进行传导速度调控;(4)须围绕"ECT组织细胞类型及缝隙连接蛋白表达"这一关键点,设计传导速度调控的可行性方案。相信随着ECT研究工作的深入开展,ECT必将对生物起搏治疗的临床转化产生重要影响。

摘要：背景:脐血中富含早期干细胞的一个亚群CD133+细胞,该亚群是具有广泛的增生和分化潜能的原始细胞,被认为具有向神经细胞分化的潜能。目的:假设脐血CD133+细胞对改善痴呆小鼠的认知功能和存活有使用价值,检测脐血CD133+细胞移植后痴呆鼠的认知和存活功能的变化,拟予验证。设计、时间和单位:完全随机区组设计的动物实验,于2005-09/2007-01在天津血液学研究所完成。材料:选用48只雄性APP695转基因小鼠,随机分为3组:对照组(n=8)、CD133+细胞移植组(n=20)和CD133-细胞移植组(n=20)。方法:对照组小鼠经脑室注射10μL磷酸缓冲液(PBS),CD133+细胞移植组和CD133-细胞移植组分别经脑室注射10μLCD133+(5×104/μL)和CD133-(5×104/μL)脐血细胞移植。主要观察指标:以水迷宫实验评价转基因小鼠在细胞移植后的认知功能,并记录移植后小鼠的存活时间。以Dil荧光标记法和免疫组化检测移植细胞的分化类型。结果:在移植后30d,CD133+细胞移植组小鼠的认知功能明显好于CD133-细胞移植组和对照组,差异有显著性意义(P<0.05),这种改善效果在移植后180d仍然存在(P<0.05)。CD133+细胞移植组小鼠平均存活时间比CD133-细胞移植组和对照组明显延长,差异有显著性意义(P<0.05)。标记有Dil的脐血细胞在移植后30d已经迁移到多个脑区,其中主要在双侧顶叶皮质和海马区,并且能够表达神经细胞标志Ⅲ型β微管蛋白、神经微丝、神经烯醇化酶和胶质酸性蛋白。CD133-细胞移植组脑切片内,Dil标记的脐血源细胞主要分布在侧脑室及其周围,很少能检测到阳性胶质酸性蛋白,Ⅲ型β微管蛋白,或神经烯醇化酶的脐血细胞。移植后30d,CD133+细胞移植组Dil标记的脐血细胞表达III型β微管蛋白的百分率明显高于180d,表达神经烯醇化酶的脐血细胞百分率明显低于180d,差异均有显著性意义(P<0.01)。结论:实验结果提示,移植CD133+细胞后出现的对认知功能改善和对存活时间延长的作用,可能主要归功于移植细胞对功能不良细胞的替代或者对神经环路的改善。

摘要：目的探讨同种异体骨髓单个核细胞（BMMNCs）移植对脊髓全横断损伤区局部微环境中巢蛋白和突触素I表达的影响及意义。方法120只清洁级Winstar大鼠（雌雄不拘）随机（随机数字法）取87只分为3组。假手术组29只：切除相应的椎板不损伤脊髓；模型组29只：建立脊髓全横断模型；细胞移植组29只：建立脊髓全横断模型后，给予BMMNCs移植治疗。各组大鼠分别于5d、1周、2周、4周利用免疫组织化学技术、RT-PCR检测脊髓组织中巢蛋白（nestin）与突触素I（SynapsinⅠ）的表达变化及利用MIAS-2000图像处理系统分析观察nestin和SynapsinⅠ阳性产物在脊髓的分布，并测量阳性产物的吸光度值。采用SPSS17．0统计分析数据，组间比较，方差齐者采用完全随机设计资料的方差分析，样本问的两两比较用q检验；方差不齐者用成组设计多个样本比较的秩和检验（Kruskal-Wallis法），样本问两两比较的秩和检验（Nemenyi法）；P〈0．05为差异具有统计学意义。结果免疫组织染色、RT-PCR及图像处理系统分析结果显示模型对照组在伤后约5d可见损伤区域附近nestin表达升高，2周达高峰，4周后nestin表达明显下调，细胞移植组在脊髓伤5d可见损伤区域附近nestin表达升高，1周达高峰，4周后nestin表达明显下调，且各时期与假手术组、模型组相比较差异均具有统计学意义（P〈0．05）。损伤5d后，在损伤区域出现突触素I的表达，但模型组、细胞移植组突触素I的表达量在各时间点均低于假手术组，细胞移植组高于模型组（P〈0．01）。结论同种异体的骨髓单个核细胞移植可能改变了局部的微环境并上调了脊髓内巢蛋白和突触素I的表达。

摘要：背景:微囊化基因工程细胞移植治疗需要制备大量的细胞活性良好、重组蛋白表达量高的生物微胶囊,体外培养和冷冻保存是生物微胶囊制备过程中两个重要的环节。目的:考察体外培养时间和冷冻保存对微囊化细胞在动物体内生长和内皮抑素表达的影响及体外培养时间对微囊化细胞冷冻保存的影响。设计、时间及地点:于2006-04/10在大连化学物理研究所生物医用材料实验室完成实验。材料:海藻酸钠与聚赖氨酸为美国Sigma公司产品。方法:将微囊化的重组内皮抑素细胞分装于24孔板中;每孔分装0.1mL微胶囊,加入DMEM/F12培养液2mL。微囊化细胞在37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。每2d采用MTT法测微囊内的活细胞密度,并收集培养上清测内皮抑素表达量。主要观察指标:微囊化细胞生长情况和内皮抑素表达量。结果:体外培养时间对微囊化细胞在动物体内生长、内皮抑素表达和微囊稳定性具有较大的影响,体外不培养和培养4d的微囊化细胞在小鼠腹腔内生长良好、内皮抑素表达量高,并且微囊稳定性好,而体外培养8d的微囊化细胞在移植后的第26天破裂。体外培养时间对微囊化细胞冷冻保存也具有较大的影响,体外培养4和8d的微囊化细胞在液氮中冷冻保存40d,复苏后细胞生长良好、内皮抑素表达量高,而冻存前未经过体外培养的微囊化细胞,复苏后细胞几乎全部死亡。结论:生物微胶囊在体外比较适宜的培养时间为4d。并且冷冻保存对微囊化细胞在动物体内生长、内皮抑素表达和微囊稳定性没有显著的影响。