摘要：目的探讨α7神经型尼古丁受体（nAChR）表达改变与淀粉样蛋白前体蛋白（APP）代谢、细胞存活率及脂质过氧化水平的关系，以了解α7 nAChR的神经保护作用，以及该受体水平与阿尔茨海默病发病的关系。方法设计并合成α7 nAChR基因特异性小分子干扰RNA（siRNA），转染SH-SY5Y细胞；用20μmol／LDMXB处理细胞；培养48h后收集细胞，分别应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot方法检测转染细胞及DMXB处理后的细胞α7 nAChR mRNA及蛋白表达水平的变化；并用1μmol／L β-淀粉样肽25-35（Aβ25-35处理细胞，测定分泌型APP、总APP蛋白表达的变化；比色法测定脂质过氧化产物含量；MTT方法测定细胞活力。结果转染siRNA后，与对照组相比，α7 nAChR mRNA及蛋白表达量降低（抑制率分别为80％和69％）、脂质过氧化产物丙二醛含量明显增加、分泌型APP表达下降、细胞活力明显低于对照组，且能增强Aβ的细胞毒性作用；用DMXB处理细胞后能使α7 nAChR的表达增加23％、增加分泌型APP的表达、并能对抗Aβ引起的细胞活力下降及脂质过氧化水平的增强。结论α7 nAChR可能通过增强α-分泌酶对APP的切割、增强细胞抗氧化能力及对抗Aβ的神经毒性作用来发挥神经保护作用，其表达减少与阿尔茨海默病的发病机制有密切的关系。

摘要：目的探讨通过RNA干扰技术沉默TIZ基因的表达对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞生物学行为的影响。方法设计3对特异性针对TIZ基因的小分子干扰RNA（siRNA），并转染人TIZ基因表达阳性的卵巢癌SKOV3细胞中，采用实时荧光定量PCR（***）技术检测siRNA片段对TIZ基因的沉默率，筛选最佳沉默率的siRNA片段构建pGPU6／GFP／Neo—siRNA—TIZ．573重组干扰质粒，采用脂质体转染法将重组干扰质粒转染人SKOV3细胞（sh—TIZ-573／SKOV3细胞），并设阴性对照细胞sh—NC／SKOV3、阳性对照细胞sh—GA／SKOV3。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定细胞生长曲线，集落形成实验测定细胞生长能力，流式细胞仪检测细胞周期，细胞体外侵袭重建基膜实验、穿膜小室实验和体外黏附实验分别测定细胞体外侵袭、转移及黏附能力。结果QRT—PCR技术检测显示，TIZ-573siRNA片段下调TIZ基因表达的作用最明显，沉默率达62％，且成功构建pGPU6／GFP／Neo—***-573重组干扰质粒并导人SKOV3细胞中使TIZ基因表达沉默。细胞生长曲线显示，TIZ基因表达沉默后的sh—TIZ-573／SKOV3细胞较对照细胞生长加快。sh—TIZ-573／SKOV3细胞在G。／G1期所占比例（34．9％）比sh-NC／SKOV3、sh—GA／SKOV3细胞少（分别为68．8％、63。4％），分别比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。细胞集落形成实验显示，sh—TIZ-573／SKOV3细胞的集落形成率[（89．1±4．6）％]高于sh—GA／SKOV3、sh—NC／SKOV3细胞[（60．8±4．9）％、（57．0±2．6）％]，分别比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。sh—TIZ-573／SKOV3细胞的侵袭率、转移率和黏附率分别为（48．5±1．7）％、（53．6±3．4）％、（64．9±5．0）％，在TIZ基因沉默前后侵袭、转移和黏附能力无明显改变（P〉0．05）。结论下调TIZ基因的表达对卵巢癌细胞生长有一定的促进作用，其可能发挥抑癌基因的生物学作用。

摘要：目的 应用RNA干扰（RNAi）技术沉默hMSH2基因后,观察其对紫杉醇耐药的卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞系OC3/TAX300细胞耐药性的影响.方法 设计靶向沉默耐药基因hMSH2的小分子干扰RNA（siRNA）序列,转染OC3/TAX300细胞（实验组）,以转染随机无关序列的细胞为阴性对照组,未转染的细胞为空白对照组.（1）采用实时定量逆转录（RT）-PCR技术和蛋白印迹法分别检测3组细胞中hMSH2 mRNA和蛋白的表达.（2）采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测紫杉醇（2 μg/ml,下同）作用12、24、48、72 h后3组细胞的增殖能力（以细胞生长抑制率表示）,流式细胞术检测紫杉醇作用24、48 h后3组细胞的细胞凋亡率和细胞周期比例,透射电镜观察紫杉醇作用48 h后3组细胞的形态学改变.结果 （1）实验组细胞中hMSH2mRNA的相对表达水平为0.004±0.000,低于阴性对照组的0.053±0.006和空白对照组的0.057±0.012（P＜0.05）;hMSH2蛋白的相对表达水平为0.19±0.04,低于阴性对照组的1.00±0.07和空白对照组的0.95±0.03（P ＜0.05）.（2）紫杉醇作用24、48、72 h后,实验组细胞生长抑制率均明显高于阴性对照组和空白对照组（P＜0.05）;紫杉醇作用24、48 h后,实验组细胞的凋亡率和G2/M期细胞比例均明显高于阴性对照组和空白对照组（P＜0.05）;而阴性对照组细胞的生长抑制率、凋亡率、G2/M期细胞比例分别与空白对照组,差异均无统计学意义（P＞0.05）.透射电镜下观察,紫杉醇作用48 h后,实验组大多数细胞可见细胞固缩,部分出现核碎裂和凋亡小体,核仁消失,线粒体明显肿胀,胞质内可见大量空泡状结构;而阴性对照组和空白对照组大多数细胞形态较规则,细胞核位于细胞中央,核仁清晰,线粒体轻度肿胀.结论 RNAi技术沉默紫杉醇耐药的卵巢癌细胞系OC3/TAX300细胞中hMSH2基因的表达后,可逆转OC3/TAX300细胞对紫杉醇的耐药性.

摘要：目的利用规律性重复短回文序列簇/相关基因9(CRISPR/Cas9)编辑技术构建真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)基因敲除的人乳腺癌MCF-7、ZR-75-1细胞系。方法设计能特异性针对4EBP1基因的特异性向导RNA(sgRNA),以lentiCRISPRv2质粒为骨架构建能表达sgRNA和Cas9蛋白的重组质粒。测序鉴定后将重组质粒与逆转录病毒包装质粒pMD2.G、psPAX2共同转入HEK293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒上清感染人乳腺癌MCF-7、ZR-75-1细胞。利用嘌呤霉素筛选4EBP1表达缺失的MCF-7、ZR-75-1细胞,DNA测序和Westernblot验证。在MCF-7、ZR-75-1野生型与4EBP1基因敲除的细胞中转人pcDNA3-rluc-poli-IRESfluc质粒,并用双荧光素酶报告基因实验检测4EBP1、4EBP1不同突变体对帽子依赖翻译的影响,以海肾荧光素酶与萤火虫荧光素酶比值(R/F比值)来表示帽子依赖的翻译水平。R/F比值的组间比较采用t检验,两两比较采用LSD法。结果Western blot结果显示构建的3种lentiCRISPRv2-4EBP1-KO重组质粒转染MCF-7、ZR-75-1细胞后,4EBP1蛋白的表达水平均明显降低,说明4EBP1基因敲除成功。DNA测序发现MCF-7细胞的DNA序列中sgRNA出现了T碱基的插入突变,在ZR-75-1细胞DNA序列中sgRNA出现了GC碱基的缺失突变,证明细胞基因组DNA中的基因编辑成功。野生型和4EBP1基因敲除的ZR-75-1细胞中测得的R/F比值分别为1.83±0.10和5.48±0.33,组间比较差异有统计学意义(t=-18.338,P<0.001)。野生型和4EBP1基因敲除的MCF-7细胞中测得的R/F比值分别为1.17±0.06和2.03±0.20,组间比较差异有统计学意义(t=-7.167,P<0.001)。4EBP1基因敲除、敲除后分别转染4EBP1、plv-neo-4EBP1-37/46和plv-neo-4EBP1-4A的4种ZR-75-1细胞中测得的R/F比值分别为5.48±0.33、3.83±0.10、3.53±0.23和1.87±0.05,组间比较差异有统计学意义(F=151.995,P<0.001);4种MCF-7细胞中测得的R/F比值分别为2.03±0.200、1.37±0.14、1.90±0.19和1.20±0.17组间比较差异有统计学意义(F=5.744,P=0.001)。结论4EBP1基因敲除乳腺癌细胞系可用于后续不同4EBP1磷酸化突变体对翻译起始作用的进一步研究。

摘要：目的探讨下调甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌（卵巢癌）SKOV3／DDP细胞体内外生物学特性的影响。方法（1）MTRR基因下调的SKOV3／DDP细胞系的构建及鉴定：设计4个针对MTRR基因不同靶序列的短发夹状RNA（shRNA），分别为U6-GFP-Neo-homo-1106、U6-GFP—Neo-homo-1931、U6-GFP—Neo-homo-419、U6-GFP-Neo—homo-1460，蛋白印迹（western blot）法筛选干扰效果最好的针对MTRR基因的shRNA连接至pSicoR质粒，建立重组慢病毒干扰载体（即pSicoR-1106）并感染SKOV3／DDP细胞，流式细胞仪筛选稳定转染的细胞，逆转录（RT）-PCR技术及western blot法验证转染后细胞中MTRR mRNA和蛋白的表达。（2）体外实验：实验分为3组，重组慢病毒干扰载体pSicoR-1106、阴性对照质粒pSicoR-NC及包装质粒采用脂质体法分别转染肾上皮细胞系293T细胞，所得病毒上清液感染SKOV3／DDP细胞，所得感染后细胞即为下调MTRR基因的SKOV3／DDP-MTRRi细胞（SKOV3／DDP-MTRRi组）以及阴性对照SKOV3／DDP-NC细胞（SKOV3／DDP-NC组，作为阴性对照）和未转染的SKOV3／DDP细胞（SKOV3／DDP组，作为空白对照）。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定3组细胞的生长情况及其对顺铂的耐药性[以50％抑制浓度（IC50）表示]；不同浓度（0、1、2、4μg／m1）的顺铂作用后，克隆形成实验检测3组细胞的克隆形成情况，流式细胞仪检测3组细胞的细胞周期比例。（3）体内实验：将上述3组细胞接种于裸鼠的腹股沟皮下，建立卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型。以2．5mg/kg顺铂腹腔注射（每2天1次，共21次）后，观察3组（每组8只）裸鼠移植瘤的生长情况，采用免疫组化SP法检测3组裸鼠移植瘤组织中MTRR、细胞增殖相关核抗原（Ki-67）蛋白的表达。结果（1western blot法筛选的干扰效果最好的针对MTRR基因的shRNA为U6-GFP-Neo-homo-1106，以此建立重组慢病毒干扰载体pSicoR-1106，转染SKOV3／DDP细胞后，其MTRRmRNA和蛋白的表达明显减弱，证实下调MTRR基因表达的SKOV3／DDP细胞系构建成功。（2）MTT比色法检测显示，第5天开始，SKOV3／DDP—MTRRi组细胞的生长速度明显慢于SKOV3/DDP-NC组和SKOV3／DDP组（P〈0．05）；SKOV3／DDP—MTRRi组、SKOV3／DDP-NC组、SKOV3/DDP组细胞对顺铂的IC50分别为4．01、7．90、8．91μg／ml，SKOV3／DDP—MTRRi组明显低于SKOV3／DDP-NC组和SKOV3／DDP组（P〈0．05）。不同浓度（0、1、2、4μg／m1）的顺铂作用后，克隆形成实验检测显示，各浓度下SKOV3／DDP-MTRRi组克隆形成个数均明显少于SKOV3／DDP-NC组、SKOV3／DDP组（P〈0．05）；流式细胞仪检测显示，当顺铂浓度为4μg／ml时，SKOV3／***组细胞的GJG。期比例为（72．8±5．0）％，明显高于SKOV3／DDP-NC组及SKOV3／DDP组[分别为（64．4±2．5）％、（64．3±3．0）％，P〈0．05]。（3）裸鼠腹腔内注射顺铂6周后，SKOV3／DDP-MTRRi组、SKOV3／DDP—NC组、SKOV3／DDP组裸鼠移植瘤的体积分别为（97±32）、（168±45）、（173±32）mm^3，移植瘤质量分别为（0．36±0．17）、（1．08±0．17）、（1．11±0．20）g，SKOV3／DDP-MTRRi组上述指标均明显低于SKOV3／DDP-NC组、SKOV3／DDP组（P〈0．05）。3组移植瘤组织中，MTRR蛋白的阳性表达率分别为2／8、5／8、7／8，Ki-67蛋白的阳性表达率分别为118、6／8、7／8，SKOV3／DDP—MTRRi组上述指标均明显低于SKOV3／DDP-NC组、SKOV3／DDP组（P〈0．05）。结论MTRR基因表达下调后在体内外均能降低顺铂耐药的卵巢癌SKOV3／DDP细胞的增殖能力，并增加其对顺铂的敏感性。

摘要：目的利用短发夹RNA（shRNA）下调Smoothened（SMO）基因的表达，研究SMO对乳腺癌干细胞增殖的影响。方法设计针对人SMO基因的shRNA，转染人乳腺癌MCF-7细胞系，G418筛选出稳定下调SMO基因的细胞株。体外：活细胞计数试剂盒（CCK8）检测细胞增殖的变化，流式细胞仪检测CIM4＋／CD24-乳腺癌干细胞比例，悬浮球培养检测乳腺球形成的能力，Westernblot检测SMO、GLIl及Oct4的表达。体内：每3天检测各组裸鼠成瘤情况，免疫组织化学SP法检测SMO的表达，Westernblot检测SMO、GLIl及Oct4蛋白的表达。结果21d后筛选出稳定下调SMO基因的MCF-7细胞。CCK8结果显示下调SMO基因可以抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖。流式细胞仪显示下调SMO基因后，CD44＋／CD24-细胞和乳腺癌干细胞球形成的比例明显降低。下调后裸鼠的肿瘤生长速度下降。免疫组织化学检测显示阴性对照组中SMO阳性表达比例为5／5，***组阳性比例为2／5。两组肿瘤组织中SMO的蛋白表达水平分别为0．72±0．17和0．21±0．09，GLIl的蛋白表达水平分别为1．21±0．21和0．47±0．12，Oct4的蛋白表达水平分别为0．83±0．13和0．25±0．07。SMO、GLI-1和Oct4在SMO—shRNA组中的表达明显低于阴性对照组（P〈0．05）。结论下调SMO基因可以抑制乳腺癌干细胞的增殖。

摘要：目的探讨膜-细胞骨架联接蛋白Ezrin对肾癌细胞株786-0细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法以ezrin为靶基因,以Pgenesil-1质粒为载体设计和构建重组体,设计2条发夹式RNA(shRNA),合成后克隆入载体Pgenesil-1,脂质体Lipofectamine2000转染进786-0细胞,观察RNA干扰Ezrin后肾癌细胞株786-0细胞增殖及侵袭能力的改变。结果稳定转染细胞荧光定量PCR结果显示shRNA-ezrin1对ezrin mRNA的表达量抑制率66.33%,稳定转染细胞Ezrin下调率达93%,shRNA干扰后786-0细胞增殖活性减弱,GO/G1时段明显延长(P<0.01),PI缩短(P<0.01),细胞凋亡率增加(P<0.01);细胞黏附力减弱,细胞运动、穿孔能力减弱(P<0.01)。结论 RNA干扰Ezrin可有效抑制786-0细胞增殖活性、降低细胞的侵袭力,Ezrin在人肾癌细胞增殖、侵袭中发挥重要作用。

摘要：目的:构建再生蛋白Iα(regeneration gene Iα,RegIα)的cDNA过表达质粒表达载体,在体外评价其对胃癌细胞株增殖及其凋亡的影响。方法:根据RegIαcDNA的全序列设计引物,用RT-PCR的方法从胃黏膜组织的总RNA中获取RegIα的cDNA编码区域的全序列,经测序其与目的基因序列一致。将获取的RegIα序列经TA克隆和亚克隆至pIRES2-EGFP真核表达质粒载体中;将构建的RegIα过表达质粒载体pIRES2-RegIα-EGFP转染胃癌细胞株MKN28,并用空载体pIRES2-EGFP作为对照,利用G418筛选稳定表达pIRES2-RegIα-EGFP的MKN28细胞株。通过RT-PCR及Western blot检测转染后细胞RegIα在mRNA及蛋白质水平的表达;MTT法和流式细胞仪分别检测RegIα过表达后MKN28细胞增殖及拮抗H2O2诱导凋亡的变化。结果:成功构建RegIαcDNA的全序列表达质粒。RT-PCR及Western blot检测显示:转染pIRES2-EGFP质粒的MKN28细胞RegIαmRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05);MTT试验显示:转染后细胞增殖能力明显升高(P<0.05),而且拮抗H2O2凋亡的能力增强(P<0.05)。结论:RegIα的过表达能明显增强胃癌细胞MKN28的增殖和拮抗H2O2诱导凋亡的能力。

摘要：目的探讨通过RNA干扰技术抑制α3神经型尼古丁受体（nAChR）基因表达后该受体对神经细胞抗氧化能力的影响，来了解α3 nAChR的神经保护作用。方法设计并体外合成α3 nAChR的特异性编码siRNA序列的寡核苷酸，退火后克隆至pSilencer 3．1-H1 neo质粒中，构建重组质粒α3 nAChR pSilencer 3．1-H1 neo。将α3 nAChR pSilencer 3．1-H1 neo转染SH-SY5Y细胞，用含G418的培养液筛选，挑选阳性克隆后采用即时荧光定量PCR和Western blot方法检测转染细胞中α3 nAChR mRNA及蛋白表达水平的变化。用1μmol／L β-淀粉样肽1-42（Aβ1-42）处理转染细胞后，用四甲基偶氮唑盐（MTT）方法测定细胞活力；用比色法测定其脂质过氧化产物含量、超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性。结果成功构建α3 nAChR siRNA表达质粒，转染后经G418筛选获得稳定转染重组质粒的细胞克隆株，与对照组相比，α3 nAChR mRNA及蛋白表达量均降低（抑制率分别为98％和66％）；经转染处理的细胞活力明显低于对照组，细胞中脂质过氧化产物丙二醛含量明显增加。超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性不同程度的降低；抑制α3 nAChR基因表达后能增强Aβ的神经细胞毒性作用。结论成功构建的α3 nAChR siRNA表达质粒能特异性抑制α3 nAChR基因表达，α3 nAChR基因表达抑制后可引起氧化应激水平升高，并增加Aβ的神经毒性，表明α3 nAChR具有一定的抗氧化能力和神经保护作用。

摘要：目的研究放射性粒子125I联合化疗药物多柔比星(阿霉素,ADM)对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡的影响。方法按2×2析因设计将乳腺癌敏感株MCF-7细胞随机分成A、B、C、D 4组,A组:空白对照组;B组:单纯125I粒子组;C组:单纯ADM组;D组:125I粒子+ADM组。采用流式细胞术检测各组干预后的细胞周期分布及细胞凋亡率。结果 (1)单纯125I粒子近距离低剂量率持续照射后将MCF-7细胞阻滞于G2~M期1。25I联合ADM将MCF-7细胞周期主要集中在G0~G1期,同时伴有较大比例的细胞凋亡。(2)各组细胞的早期凋亡率分别为:A组(0.99±0.05)%、B组(19.22±4.92)%、C组(16.57±4.73)%、D组(3.16±1.08)%;各组晚期凋亡及坏死率为:A组(0.32±0.18)%、B组(3.16±1.39)%、C组(3.24±0.75)%、D组(28.99±7.96)%,D组晚期凋亡及死亡率明显提高。结论 125I放射性粒子能有效诱导乳腺癌细胞凋亡,与化疗药物ADM联合作用除诱导细胞凋亡,还可导致大量细胞死亡,具有协同、增效的作用。