摘要：细胞色素酶p450是代谢内源性物质和外源性物质的重要的酶,在药物治疗和药物开发领域以及了解潜在的毒性物质和致癌性物质的代谢机制起决定性作用。旨在构建细胞色素酶p450 3A4的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化得到CYp3A4蛋白。用逆转录-聚合酶链反应方法从人肝脏总RNA中得到CYp3A4的cDNA,然后直接插入pMD20-T Vector中,将测序正确的N-末端和C-末端进行修饰。然后利用双酶切插入到表达载体pET-28a-c(+)Vectors,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达。并通过定点突变的方法获得CYp3A4亚型p467S(CYp3A4*19)。采用SpSS13.0设计4因素2水平正交实验,对α-ALA(0.5 mmol/L和1 mmol/L)、IpTG(0.5 mmol/L和1 mmol/L)、卡那霉素(50μg/mL和100μg/mL)添加浓度及菌的接种密度(接种1%和接种2%)进行优化。并用SpSS13.0对结果进行分析,选择出比较好的组合进行下一步的大规模的诱导表达。经定点突变的方法成功获得了CYp3A4*19亚型。经IpTG诱导获得CYp3A4蛋白,并通过Western blot验证。用BCA蛋白浓度定量分析试剂盒测定的膜蛋白浓度在65μg/mL左右,α-ALA、抗生素(卡那霉素)、T7启动子诱导剂IpTG及接种密度高低两水平中对膜蛋白的表达水平的影响没有统计学意义。

摘要：目的建立TaqMan-MGB探针检测CYp2C19基因*2、*3和*17三个多态性位点的方法。方法针对CYp2C19基因*2、*3和*17位点设计合成相应引物及双标记探针。选取2021年3月至2022年6月贵州省人民医院心内科门诊已知基因型的剩余全血样本42例,覆盖每个位点的每个基因型各10例,提取DNA进行聚合酶链反应(pCR)检测,产物进行电泳和Sanger法测序分析。加样1、10、100、800 ng DNA,进行pCR检测以评价灵敏度。每个位点的每个基因型5例,每周1次对其检测,连续3周,以评价重复性。结果设计的引物扩增出目的基因片段,电泳显示明亮的单一的DNA条带;90个基因型的pCR结果与测序结果完全一致(p>0.05);不同加样量pCR法均可准确判读基因型,所有基因型在1 ng水平的Ct值均<34。同一基因型3次重复检测的结果一致。结论本研究成功建立了TaqMan-MGB探针检测CYp2C19基因*2、*3和*17三个多态性位点的方法,具有快速、准确、灵敏、简便的特点。

摘要：目的建立检测CYp3A5基因rs776746位点单核苷酸多态性(SNp)的Taqman-MGB实时荧光聚合酶链反应(pCR),并分析该位点对他克莫司药物代谢的影响。方法针对CYp3A5基因rs776746位点设计相应引物及双标记探针,建立并评价检测该位点SNp的Taqman-MGB实时荧光pCR;收集170例服用他克莫司患者的全血DNA样本,用建立的Taqman-MGB实时荧光pCR检测CYp3A5基因型,并分析不同CYp3A5基因型与他克莫司血药浓度剂量比的相关性。结果建立的Taqman-MGB基因分析法能够对CYp3A5 rs776746位点基因型进行高效区分,可检测最低含量为0.01 ng水平的DNA样本,并且具有较好的重复性和特异性,其检测结果与测序结果完全一致。170例患者中CYp3A5*1/*1型18例(10.59%)、CYp3A5*1/*3型65例(38.24%)、CYp3A5*3/*3型87例(51.18%);其中104例异体肾移植患者3种基因型的血药浓度剂量比分别为(52.47±35.96)、(77.79±33.80)、(134.80±79.35)(ng/m L)/(mg·kg-1·d-1),各组之间差异有统计学意义(p<0.05)。结论建立了一种敏感性高、特异性好、重复性佳、适用于临床快速检测CYp3A5 rs776746 SNp位点的Taqman-MGB方法。初步分析显示CYp3A5*3基因型的存在会减弱患者对他克莫司的代谢能力。