摘要：目的:研究人CYp3A4与pOR和cyt b5用悬浮细胞共表达时的最佳条件。方法:悬浮培养Sf 9细胞,分别摸索摇床的温度、转速、摇瓶中细胞液的量、表面活性剂的加量、细胞的培养时间,以及3种病毒的加量比例等条件,并进行优化;然后,将表达产物制成微粒体后用于睾酮的代谢,并分别测其代谢活性。结果:当恒温摇床的温度为27℃,转速为90 r/min,每250 ml摇瓶中加入80～120 ml细胞密度为5×105个/ml的细胞液,并加入0.1%的pluronicF-68,细胞培养72 h时,最适合细胞的生长和目的蛋白的表达。此时,当3种病毒的加量比例为1∶1∶1时,表达条件最佳,其对底物睾酮代谢的Km值、Vmax和CLint分别为119.6μmol/L、0.52μmol/(min.g蛋白)和4.34 ml/(min.g蛋白)。结论:通过三重共表达CYp3A4、pOR、cyt b5,以及对表达条件的优化,提高了目的蛋白的表达量,得到了较高代谢活性的CYp3A4,从而为新药代谢及药物-药物相互作用研究奠定了基础,为药物代谢酶的大量表达提供了可行的方案。

摘要：目的 建立针对与临床抗癌药物紫杉醇代谢相关的细胞色素p450（CYp450）酶基因多态性位点的快速、准确、高通量的基因芯片基因分型方法。方法选取CYp450酶2C8＊3、3A4＊18、3A5＊3C等3个与紫杉醇代谢相关突变位点，根据基因库中报道的序列，设计每个基因多态性位点的野生型和突变型探针，在突变位点2侧设计pCR扩增引物，pCR片段长度应〈200bp，并构建标准质粒。探针在3’端氨基修饰，下游引物标记荧光素Cy3，将探针按一定顺序点样于经醛基化处理的玻片制备成基因芯片。人体血液DNA样本分别通过3对引物扩增后与基因芯片上的探针杂交，通过扫描图像和配套软件对结果进行分析和判断。同时，对50份血液样本进行检测。结果通过标准质粒杂交结果显示，每个位点对应的1对探针均能将野生型和突变型质粒进行准确地区分，无非特异性杂交信号出现；检测50份血液样本，CYp2C8＊3位点的突变率为2％，CYp3A4}18位点均为野生型，CYp3A5＊3C位点的突变率为62％。同时，通过测序法进行验证，基因芯片方法与测序方法的结果完全一致。结论建立的同时检测抗癌药物紫杉醇代谢相关的CYp450酶基因多态性位点CYp2C8＊3、CYp3A4＊18、CYp3A5＊3C的基因芯片分型方法快速、准确，结果可靠，重复性好，可用于指导紫杉醇患者的个体化用药，并为分析个体患者对于紫杉醇药物体内代谢提供了一个高通量技术平台。

摘要：人细胞色素p450(cytochrome p450,CYp)在临床上对外源及内源性的物质代谢起着至关重要的作用。由于从人组织中获取的CYp成分较为复杂,且人组织本身不易获得,人们开始用各种表达系统来进行CYp的异源表达,并将表达得到的单一CYp用于药物代谢及药物-药物相互作用的研究,从而大大提高了药物高通量筛选的效率。另外,由于药物代谢酶的多态性使不同人群表现出对某种药物药效的差异,因此对某种CYp突变体的异源表达和药物代谢研究,将有助于指导治疗方案的优化,实施个体化药物治疗。

摘要：背景：他克莫司属大环内酯类抗生素，具有很强的免疫抑制活性。对预防。肾移植后急性排斥反应、逆转急性排斥反应和慢性排斥反应等具有良好的疗效。但他克莫司治疗窗窄，不同的患者对他克莫司的代谢存在很大的个体差异。目的：探讨细胞色素p4503A5（CYp3A5）基因多态性对他克莫司血药浓度的影响，以期发现他克莫司在不同个体间吸收、代谢差异的基因背景，建立个体化用药的药物代谢遗传学监控体系。设计、时间及地点：病例对照观察，于2006—09／2008-03在北京中医药大学附属东直门医院。肾移植中心和解放军第二炮兵总医院临床药理中心完成。对象：选择北京东直门医院和解放军北京军区总医院正在随访的肾移植术后6个月以上稳定期患者62例，男34例，女28例，年龄25～68岁，体质量45～86妇。同期汉族健康献血者92名为正常对照组，年龄1847岁，男49名，女43名。方法：患者均使用他克莫司＋霉酚酸酯＋强的松三联免疫抑制治疗，调整剂量使他克莫司血药浓度在5-81μg/L左右，2次／d。除1例患者由服用环孢素A切换为他克莫司1年外，其他患者均肾移植后即服用他克莫司，持续半年以上。主要观察指标：①用偏振荧光免疫法测定无影响条件下3次他克莫司全血谷浓度指标。②监测血常规、肝。肾功能、血糖等生化指标。③聚合酶链反应方法扩增CYp3A5^＊3目的基因片段，直接测序的方法检测CYp3A5^＊3的多态性。④比较不同基因型之间他克莫司的浓度／剂量比的差异。结果：CYp3A5^＊3基因6986A→G中，^＊1／^＊1型为6例（9．7％），^＊1／^＊3型为26例（41．9％），^＊3／^＊3型为30例（48．4％）。^＊1／^＊1型和^＊1／^＊3型患者的他克莫司浓度／剂量比明显低于^＊3／^＊3型的患者（p均〈0．01），^＊1／^＊1型纯合子的血药浓度略低于^＊1／^＊3型杂合子，但无统计学意义。患者的肝。肾功能、血糖、血红蛋白等指标在3组之间比较无统计学意义。结论：CYp3A5^＊3基因多态性与他克莫司的服用剂量密切相关。对含CYp3A5^＊3等位基因的患者在应用他克莫司时应较常规减少用药剂量并注意副作用的发生。而对CYp3A5野生型的。肾移植患者应适当增加服药次数以降低排异反应。

摘要：背景:细胞色素p450(CYp)2C19代谢美芬妥英的酶活性在人群中呈快代谢型和慢代谢型二态分布。突变型等位基因是CYp2C19基因多态性的分子生物学基础。目的:对原发性肝细胞癌(HCC)患者的CYp2C19等位基因进行基因分型,探讨CYp2C19基因多态性与原发性HCC的关系。方法:纳入48例原发性HCC患者和88名健康对照者。设计相应引物,以聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(pCR-RFLp)方法检测CYp2C19m1和CYp2C19m2突变型等位基因,对两组基因多态性进行分析比较。结果:HCC组CYp2C19慢代谢型(m1/m1和m1/m2)发生率为25.0%(12例),与健康对照组的11.4%(10例)相比差异有统计学意义(p<0.05,OR=3116,95%CI:1140～7113)。结论:CYp2C19慢代谢型与原发性HCC之间存在相关性,可能增加人群对HCC的易感性。

摘要：目的：探索适合多位点同步检测的SNp扩增方案和杂交检测条件，建立芯片杂交信号判读的标准。方法：设计多重扩增的引物和探针；优化荧光标记引物的多重pCR条件。自行制备氨基化片基并点样制片，激光共聚焦扫描后判读检测结果。结果：野生与突变探针杂交信号比值大于4或小于2．5对分型结果的判断有意义，而当信号值在2．5～4范围内应重新检测分析。结论：通过多片段同步扩增和不同位点平衡杂交的实现，本方法适于流行病学调查，体现了寡核苷酸芯片对药物代谢酶多态性基因分型的优势。