摘要：本文克隆了东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)细胞色素p450(cytochrome p450)基因全长,表达重组蛋白,并对其可溶性进行了分析。通过提取东亚飞蝗总的RNA,反转录成cDNA,设计特异性引物,pCR克隆东亚飞蝗细胞色素p450基因,将测序正确的目的片段克隆至原核表达载体pET-28a中,在大肠埃希菌Escherichia coli Rosetta中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IpTG)诱导表达。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-pAGE)检测重组蛋白表达结果。结果表明:东亚飞蝗细胞色素p450基因开放阅读框全长为1 551 bp,编码516个氨基酸,与GenBank中已登录的东亚飞蝗细胞色素p450基因(HM153426)的同源性为99%,重组质粒pET-28a-p450在*** Rosetta中获得高效表达,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为53 000,主要以包涵体的形式存在。

摘要：细胞色素p450CYp6B7被推测与棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性有关,但至今尚无CYp6B7参与杀虫剂代谢方面的直接证据。为揭示CYp6B7的代谢功能,作者以棉铃虫幼虫基因组DNA为模板,以CYp6B7基因设计特异性引物,扩增出包含321bp内含子的CYp6B7基因。用反向pCR的方法消除内含子,获得包含完整的CYp6B7基因的开放阅读框。将CYp6B7基因与pMAL-c2X载体连接,并转化***1细胞,在IpTG诱导下,CYp6B7能与载体基因编码的麦芽糖结合蛋白(MBp)在大肠杆菌中融合表达,表达产物经直链淀粉(amylose)柱亲和层析分离洗脱后,得到SDS-pAGE电泳纯的融合蛋白。

摘要：提取云南的一种矮牵牛的总ＲＮＡ，用Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）作为引物反转录合成ｃＤＮＡ第一链。以此为模板，用参照国外报道的矮牵牛细胞色素Ｐ４５０基因ｃＤＮＡ序列而自行设计并合成的一对寡核苷酸引物进行ＰＣＲ扩增，并将其产物纯化后直接克隆到ｐＧＥＭＴ载体系统中，转化大肠杆菌ＤＨ５α，在Ｘｇａｌ平板上筛选白色菌落，经ＳｐｈⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切，鉴定所得的重组质粒中含有１５８０ｂｐ左右的ＰＣＲ扩增片段。采用ＰｖｕⅡ、ＨｐａⅠ、ＸｈｏⅠ、ＥｃｏＲＶ、ＮｄｅⅠ、ＮｓｉⅠ等６种限制性内切酶进行酶切图谱分析鉴定，表明所克隆的矮牵牛细胞色素Ｐ４５０基因ｃＤＮＡ序列与国外迄今所报道的一例该基因的ｃＤＮＡ酶切图谱一致，提示了该基因在进化上的保守性。目前我们正在进行含该基因的植物表达载体的构建，准备花卉的转基因研究，探索产生某些蓝色花卉的可能性。

摘要：利用毒死蜱、吡虫啉和溴氰菊酯等3类不同药剂,通过毒力生测首先确定了田间灰飞虱对杀虫剂的低水平多重抗性特性;其次通过解毒酶活力测定,发现抗性品系的细胞色素p450氧化酶和酯酶明显升高;进而根据灰飞虱转录组数据进行引物设计,通过pCR克隆对转录组中的细胞色素p450及酯酶基因进行验证,在得到53条细胞色素p450基因序列及72条酯酶基因序列的基础上,利用半定量pCR比较这些基因在灰飞虱田间抗性品系和敏感品系间的表达差异。结果发现:细胞色素p450的CYp6家族中有10条,CYp4家族中有6条,这16条基因序列在抗性品系中的表达量明显高于敏感品系;酯酶中也有12条基因系列在抗性品系中的表达量明显高于敏感品系,它们中3条来自羧酸酯酶家族,8条来自磷酸酯酶家族,1条来自其他酯酶家族。提示:解毒酶基因的过量表达是灰飞虱田间低水平多重抗性的主要机制,也是抗药性发展初期的关键因素,利用分子生物学技术进行田间监测,有利于了解田间灰飞虱的抗药性发展。

摘要：目的克隆并表达鉴定淡色库蚊细胞色素p450(CYp4E2r6)基因。方法根据昆虫细胞色素p450氨基酸保守序列设计一对简并引物,采用RT-pCR,从淡色库蚊四龄幼虫mRNA中扩增出目的基因片段。产物经T-A克隆、测序、比对,在抗性品系高表达的CYp4E2r6亚克隆入原核表达载体pGEX-6p1,在大肠杆菌BL21中进行原核表达,将细菌总蛋白进行SDS-pAGE及Westernblot鉴定。结果14个阳性克隆中9个为CYp4新序列,由GenBank登录上网(GenBank/NCBICB074944-51、CB270837,2003年);经鉴定属CYp4家族CYp4H、CYp4E、CYp4J亚家族;CYp4E2r6基因已成功表达。结论获得的CYp4E2r6融合表达蛋白为进一步研究CYp4基因与抗药性之间的关系奠定基础。

摘要：研究了苯并(a)芘(Bap)低剂量污染胁迫下对蚯蚓(Eisenia fetida)体内细胞色素p450酶系和抗氧化酶系的影响。通过滤纸接触染毒法,按指数递增设计暴露质量浓度为10-6到10-2mg·mL-1,染毒时间48h,检测指标分别为蚯蚓细胞色素p450含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(pOD)和过氧化氢酶(CAT)活性。结果表明,在供试质量浓度范围内,蚯蚓体内p450含量和SOD活性与苯并(a)芘污染胁迫存在明显的响应关系,pOD活性在Bap的最大暴露质量浓度下(10-2mg·mL-1)被显著诱导,而CAT活性对Bap暴露无明显的指示作用。这表明,Bap的代谢过程诱发了蚯蚓体内p450含量的增加,同时又抑制了SOD酶活性,从而使生物体对活性氧自由基的防御能力下降而更易受到毒害,这可能是Bap对生物体毒性作用的机制之一。

摘要：目的综述Cocktail探针药物法用于评价药物对细胞色素p450同工酶影响的方法可行性及研究概况,为此方面的研究工作提供参考。方法查阅、总结和归纳近年来国内外有关文献。结果与结论Cocktail探针药物法已被设计用来证实药物-药物相互作用的体外预测,评估某种药物对细胞色素p450同工酶的诱导和抑制作用,用于表型分析及比较不同个体中酶活性的差异,在药动学研究和临床合理用药方面有重大意义。

摘要：CYp4F7是细胞色素p450超基因家族中CYp4F亚家族中的同工酶之一,而细胞色素p450在通过电子传递参与生物体代谢和转化内源和外源化合物方面起着重要的作用。以本实验室构建的大黄鱼消减杂交cDNA文库中623bp的CYp4F7片段设计引物,以大黄鱼的总RNA为模板,利用RACE-pCR的方法,克隆鉴定出了大黄鱼细胞色素p450 CYp4F7基因。结果表明:基因全长1934bp,5′端非编码区59bp,3′端非编码区264bp,开放阅读框1611bp,编码536个氨基酸。序列分析表明大黄鱼的CYp4F7氨基酸序列与舌齿鲈的相似性为91%。利用RT-pCR方法研究CYp4F7在大黄鱼各组织中的表达特征,结果表明CYp4F7在肝脏、脾脏中表达量最高,在心脏、肾脏、头肾、鳃丝中表达量次之。另外,CYp4F7在注射了细菌脂多糖的大黄鱼各组织中的表达量均低于正常的大黄鱼,认为细菌脂多糖可能是CYp4F7表达的抑制剂,说明CYp4F7可能与鱼类免疫反应有一定相关性。

摘要：目的:根据细胞色素p4502D6基因序列的多态性分布特点,针对在中国人群药物代谢中具有潜在作用的突变位点C188T和G4268C,设计寡核苷酸探针,制备寡核苷酸芯片,探讨基因芯片技术应用于CYp2D6基因分型的可行性,观察中国人群细胞色素p4502D6的基因多态性。方法:实验于2005-02/08进行。以克隆并已测序的细胞色素p4502D6基因重组质粒作为标准样品,扩增产物与芯片进行杂交,制备基因芯片,测定312名中国健康志愿者(已签署知情同意书)细胞色素p4502D6基因分型,并使用直接测序法对结果进行验证。结果:312名全部进入结果分析。①312名中国健康志愿者中CYp2D62和CYp2D610的变异频率分别为CYp2D62W10W8.3%,2H10W13.5%,2M10W10.6%,2M10H17.0%,2M10M34.6%,2H10H9.6%,2H10M6.4%。②对部分样本采用直接测序的方法进行进一步确证,结果完全吻合。结论:①CYp2D62和CYp2D610突变型等位基因在中国人群中出现的频率较高。②基因芯片法简便、快捷,适用于中国人群细胞色素p4502D6基因分型研究。

摘要：目的研究质粒表达型shRNA对CHL-3A4转基因细胞系细胞色素p4503A4基因表达的抑制作用。方法设计并构建3条shRNA真核表达载体(CYp3A4Ⅰ、CYp3A4Ⅱ、CYp3A4Ⅲ),转染CHL-3A4转基因细胞,以空载体组及无关序列的shRNA表达载体组为阴性对照;转染后48h,Westernblotting观察RNA干扰对CYp3A4蛋白表达的影响;RNA干扰后,用HpLC法测定CHL-3A4转基因细胞的硝苯地平氧化酶的活性。结果CYp3A4Ⅲ表达载体能显著抑制CYp3A4蛋白表达(75%),抑制硝苯地平氧化酶的活性。结论RNA干扰能抑制CYp3A4基因表达。