摘要：目的为了将人铁氧还蛋白(adrenodoxin,FDX)在293T细胞中表达,扩增FDX的ORF,将FDX的ORF插入到哺乳动物细胞表达载体pcDNA的NotI/KpnI,构建表达载体。方法以GeneBank报道的FDX的mRNA序列(NM_004109.5)为模板设计引物,在5'和3'分别引入限制性酶切位点NotI和KpnI,从HepG2的cDNA中扩增FDX的ORF,将FDX的pCR产物和空载体pcDNA3.1用NotI和KpnI双酶切4 h,酶切产物用DNA回收试剂盒回收。将FDX的pCR酶切产物分别连接到空载体NotI/KpnI,连接产物转化DH5α,培养过夜。挑单克隆,用pCR鉴定阳性克隆并测序。结果经1%琼脂糖凝胶电泳和EB染色,观察到一500 bp条带,阳性克隆的测序结果与GeneBank报道的核酸序列一致。结论应用常规分子克隆方法已成功构建了FDX的真核表达载体pcDNA-FDX。

摘要：目的从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系Ⅳ龄幼虫扩增并分析CYp4E2r6基因,为蚊虫抗药性的研究、检测和防治筛选靶标。方法根据已扩增的CYp4E2r6基因片段(长470bp,GenBank登录号为CB074945)的序列设计2条特异引物,从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系Ⅳ龄幼虫提取RNA,反转录成cDNA,以cDNA为模板,用5′-RACE和3′-RACE方法,各获得722bp、617bp片段。进行序列拼接并对所得新基因进行登录和生物信息学分析。结果获得了1条3′端含polyA尾,长1025bp的CYp4E2r6基因大片段(GenBank登录号为AY309972),编码289个氨基酸,与果蝇细胞色素p450氨基酸的同源性为55%。编码蛋白的理论分子质量单位为32.9ku,等电点为5.8。结论获得了CYp4E2r6基因大片段,为进一步获取全长基因并研究该基因的功能奠定了基础。

摘要：目的研究质粒表达型短发夹RNA(smallhairpinRNA,shRNA)对CHL-3A4转基因细胞的细胞色素p4503A4(cytochromep4503A4,CYp3A4)基因表达的影响。方法设计并构建3条shRNA真核表达载体(CYp3A4Ⅰ、CYp3A4Ⅱ、CYp3A4Ⅲ),脂质体转染CHL-3A4转基因细胞。转染48h后,TR-pCR和WesternBlotting分别观察3条shRNA对CYp3A4mRNA和蛋白表达的影响;噻唑蓝(MTT)观察shRNA抑制环磷酰胺对CHL-3A4转基因细胞毒性作用。结果CYp3A4Ⅲ表达载体的shRNA分别能抑制CHL-3A4细胞的CYp3A4mRNA表达(70%)及蛋白表达(75%),抑制环磷酰胺对CHL-3A4细胞(75%)细胞毒作用。结论RNA干扰能显著抑制CYp3A4基因的表达,RNA干扰技术为肝细胞色素p450的研究提供了新的方法。

摘要：目的 :建立细胞色素p4 50 2D6(CYp2D6)第 3 0 2 3位A→C突变造成CYp2D6酶活性缺陷的等位基因CYp2D6E的测定方法。方法 :利用等位基因特异扩增法 (ASA)为基本原理 ,设计两对引物分别扩增野生型等位基因和突变型等位基因。结果 :经 3 96例测定 ,发现 2例CYp2D6E与CYp2D6B的异突变型纯合子 ,其表现型均为慢代谢者。阳性对照说明本法重复性好 ,阴性对照显示本法无污染问题。结论 :本法比pCR -RFLp法更为快捷、更少污染。

摘要：目的研究在大肠杆菌中以重组病毒样颗粒形式表达的人II型自身免疫性肝炎标志蛋白CYp2D6主要抗原表位aa262-270免疫小鼠后对构建小鼠自身免疫性肝炎模型的效应。方法设计人II型自身免疫性肝炎标志蛋白主要抗原表位aa262-270(WDpAQppRD)的正负链寡核苷酸片段,经退火后插入表达乙肝核心蛋白HBcAg的质粒pNp中(pNp质粒由pThioHisA质粒插入HBcAg基因片段构建而成)。构建成质粒pNp-AIH2;转染大肠杆菌DH5α感受态细胞;以IpTG诱导重组蛋白表达,经硫酸铵沉淀、洗涤,密度梯度离心纯化和脱盐后,肌肉注射免疫小鼠3次,以ELISA和western blot检测免疫后小鼠特异性抗体的产生和水平,通过转氨酶检测和肝脏石蜡切片HE染色观察炎症反应。结果 SDS-pAGE结果显示重组菌诱导表达的目的蛋白分子量为19kD,与预期相符;电镜证实其以可溶性的病毒样颗粒形式存在;ELISA显示,免疫小鼠血清与包被的肝脏匀浆蛋白特异反应,检测到持续存在的特异抗体,滴度至少为1:2000;western blot检测表明,抗血清在分子量约为55kD的地方产生了一个特异的条带,与小鼠CYp2D6蛋白大小一致。与正常对照相比,实验组小鼠转氨酶水平未明显升高,肝切片HE染色没有观测到明显的病理特征。结论携带人II型自身免疫性肝炎标志蛋白CYp2D26主要表位的病毒样颗粒免疫小鼠后,可刺激产生较强的特异抗体水平,但在观测时间内,未见诱导小鼠产生明显的肝脏炎症反应。

摘要：目的分析21-羟化酶缺乏症(21-hydroxylase defi ciency,21-OHD)患儿和家系基因突变特征及突变基因型与临床表型的关系。方法采用病例试验诊断研究设计。收集2011年12月至2013年5月期间就诊于上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心的16例21-OHD患儿及父母外周静脉血,抽提基因组DNA。根据细胞色素p450c21(Cytochrome p450c21,CYp21A2)基因与其假基因间序列的差异,用高特异性引物扩增该基因10个外显子及内含子序列,用pCR扩增产物直接测序法对21-OHD患儿及其家系进行基因分型。结果用pCR产物直接测序法检测与分析16例21-OHD患儿的突变基因型,共检出6种CYp21A2基因突变,其中IVS2-13A/C>G[50%(16/32)]、p.I172N[25%(8/32)]为最常见的2种类型,c.1451_1452delinsC[3%(1/32)]及p.R149p[3%(1/32)]均为罕见突变,除2例患儿未获得父母标本外,其余患儿基因突变均来自父母。失盐型患儿中最常见的突变类型为IVS2-13A/C>G[75%(15/20个等位基因)],而单纯型患者中最常见的突变为p.I172N[67%(8/12个等位基因)],患儿基因型与临床表型间具有很高一致性。结论 pCR产物直接测序法能较特异地检出21-OHD基因突变位点,并可为疾病确诊及临床表型预测提供可靠依据。

摘要：目的：研究葛根素对人细胞色素p450（ CYp）1D6酶活性的影响及其与CYp1D6基因型的关系。方法（1）体外试验：取肝内胆管结石患者手术切除标本中正常肝组织制备人肝微粒体孵育体系，加入不同浓度葛根素（0、0.015、0.050、0.100、0.100、0.400、0.800 mmol/L）及美托洛尔，以高效液相色谱法检测美托洛尔代谢产物α-羟基美托洛尔产率，以此反映CYp1D6酶活性。（1）体内试验：以18名健康男性[年龄19~16（11±4）岁，体重61~75（69±7）kg]为对象，其中CYp1D6基因型为＊1/＊1、＊1/＊10、＊10/＊10者各6名。试验分3个阶段进行，采用两阶段交叉试验设计。将受试者按照简单随机化分组方法随机分为1组。第1阶段（第1~11天）：1组连续10 d静脉滴注葛根素注射液400 mg/d，另1组不给药，第11天清晨1组受试者均口服美托洛尔100 mg；第1阶段（第11~17天）：1组均不采取任何措施；第3阶段（第18~18天）：第1阶段未服药组连续10 d静脉滴注葛根素注射液400 mg/d，另1组不给药，第18天清晨1组受试者均口服美托洛尔100 mg。第11和18天口服美托洛尔100 mg后收集受试者连续8 h尿液，采用高效液相色谱法测定尿液中美托洛尔及α-羟基美托洛尔浓度，以二者之比反映CYp1D6酶活性。结果体外试验显示经0、0.015、0.050、0.100、0.100、0.400、0.800 mmol/L葛根素处理的人肝微粒体反应体系α-羟基美托洛尔产率分别为（0.018±0.001）、（0.015±0.001）、（0.015±0.001）、（0.011±0.001）、（0.011±0.001）、（0.010±0.001）、（0.005±0.001）mmol/（mg·h），α-羟基美托洛尔产率随着葛根素浓度的升高而逐渐降低，总体均数间差异有统计学意义（ F =30.750，p =0.000）。两两比较显示，0.100、0.100、0.400和0.800 mmol/L葛根素组α-羟基美托洛尔产率明显低于0、0.015、0.050 mmol/L葛根素组（ p﹤0.05），0.100、0.400、0.800 mmol/L 葛根素组明显低于0.015、0.050 mmol/L 葛根素组（ p ﹤0.05），而0.800 mmol/L葛根素组明显低于0.100、0.100、0.400 mmol/L葛根素组（ p﹤0.05）。体内试验显示18名受试者应用葛根素前后尿样中美托洛尔与α-羟基美托洛尔浓度比值分别为1.11±0.55和1.73±0.94，差异有统计学意义（ p﹤0.01）。不同CYp1D6基因型的3组受试者应用葛根素前后尿样中CYp 1D6活性变化程度组间比较，差异无统计学意义。结论葛根素对CYp1D6活性有明显的抑制作用，浓度越高抑制作用越明显，但与CYp1D6基因型无明显相关性。

摘要：任何一种新药,在临床应用前都必须检查它是否对人体有害。到目前为止,这种检查是通过动物试验或细胞培养进行的。进行动物试验或细胞培养一般需要花费数周的时间。 最近,英国萨瑞大学的研究人员推出了在计算机上检查设计的药物是否对人体有害的方法。研究人员通过在计算机屏幕上拼凑分子结构图像。