摘要：小麦蛋白质二硫键异构酶(wPDI)由4个硫氧还蛋白结构域a-b-b'-a'和C-末端c尾组成.为考察wPDI各结构域对活性的影响,通过亚克隆表达了8个不同结构域组成的wPDI截短蛋白,表达产物经分离纯化后进行了酶学性质研究和蛋白质电泳分析.结果表明,所设计的8个wPDI截短蛋白在大肠杆菌BL21中得到了表达,金属螯合亲和层析和分子排阻层析后获得了纯度较高的wPDI截短蛋白;活性测定结果表明,wPDI的所有结构域对其二硫键氧化还原活性和分子伴侣活性都有贡献,c尾缺失不影响其异构活性,但提供了分子伴侣活性的关键氨基酸结合位点;对截短蛋白A和A'的电泳分析发现,wPDI的a结构域活性位点主要以氧化态为主,而a'结构域主要以还原态为主.研究结果为深入理解wPDI的功能性质奠定了基础.

摘要：以含新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)基因的重组质粒为模板,设计特异引物进行重叠-延伸PCR扩增获得F基因的抗原结构域基因片段Fa、Fb和Fa-l-Fb,经SalⅠ和NotⅠ酶切后,定向插入原核表达载体pGEX-6P-1,获得重组质粒pGEX-Fa、pGEX-Fb和pGEX-Fa-l-Fb;用定点突变方法获得重组质粒pGEX-Fa-mut.将重组质粒转化大肠杆菌BL21,转化菌经IPTG诱导、提取表达产物进行蛋白电泳和免疫印迹分析.结果表明:Fa-mut、Fb和Fa-l-Fb结构域基因均获得了融合表达,表达产物与NDV阳性血清具有免疫反应性;与pGEX-Fa-mut不同,pGEX-Fa重组质粒在大肠杆菌中未能表达,且转化菌在IPTG诱导过程中未见生长,提示未经突变的Fa片段可能为毒性蛋白.三维结构预测结果显示,目的蛋白片段中均保留F蛋白中原有相应的抗原表位.

摘要：为构建HMG-17原核表达系统,研究HMG-17抗菌功能与结构的关系,提取人LAK细胞总RNA,设计合成相应引物,应用RT-PCR扩增HMG-17和HMG-17α螺旋结构成熟肽cDNA,以pGEX-1λT为载体,构建HMG-17和HMG-17α螺旋结构基因大肠杆菌表达载体。该载体表达的融合蛋白GST-HMG-17和GST-HMG-17α经亲合层析、凝血酶酶切、AU-PAGE胶回收后获得高度纯化的HMG-17和HMG-17α肽,对纯化产物进行MEC、MIC、MBC等试验,与杀菌活性较强的抗菌肽HNP-1、NP-1进行活性对比,证明其具有较强的杀菌活性,且具有盐敏感性。并证明了HMG-17的α结构域是HMG-17的主要抗菌功能区域。

摘要：以热产硫化氢高温厌氧杆菌菌液为模板,根据Gene Bank中登记的编码结构域Tt APuX21基因序列设计1对特异引物,利用多聚酶链反应技术,扩增出目的基因Tt apux21,并克隆到表达载体pET21a(+)中。经菌液PCR筛选和DNA测序鉴定,表达载体pET21a(+)中插入有序列正确的Tt apux21基因,重组质粒命名为pEX21。

摘要：【目的】探究鸭坦布苏病毒(Duck Tambusu virus,DTMUV) E蛋白全长及其结构域I、II和III (DI、DII和DIII)对鸭胚成纤维细胞(Duck embryo fibroblast,DEF)的细胞周期与凋亡的影响。【方法】本研究设计、合成DTMUV E蛋白全长及其DI、DII和DIII真核表达质粒,并转染至DEF,用流式细胞仪检测不同蛋白引起的DEF细胞凋亡和细胞周期的变化。【结果】细胞凋亡结果显示:质粒转染细胞24 h后,E蛋白全长及DI、DII、DIII诱导的DEF早期凋亡率分别是16.4%、15.1%、14.0%和17.2%;质粒转染细胞36 h后,E蛋白全长及DI、DII、DIII诱导的DEF早期凋亡率分别是23.4%、18.5%、26.7%和29.4%。细胞周期检测结果显示:E蛋白全长及DI、DII、DIII的质粒转染细胞24、36 h后,DNA合成期(S期)细胞比例都明显高于pEGFP-N1空载体转染组。质粒转染24 h后,E蛋白及DI、DII、DIII的S期细胞比例分别为5.43%、22.58%、12.75%和12.80%;质粒转染细胞36 h后,E蛋白及DI、DII、DIII的S期细胞比例分别为9.98%、11.44%、10.44%和11.00%。【结论】DTMUV E蛋白全长及其3个结构域均能诱导早期细胞凋亡,引起细胞S期的停滞,但是各蛋白片段诱导细胞凋亡和引起细胞周期变化的能力存在一定差异。

摘要：植物体内存在着非常精巧的光信号调节系统以适应外界光环境的变化,COP1蛋白是这个调节系统中介导光信号转导的一个关键因子.利用从豌豆克隆的COP1的cDNA,根据豌豆COP1的蛋白结构设计了4种不同的结构域基因片段,构建了这4个片段及COP1全基因与GFP融合基因的植物表达载体,通过根癌农杆菌分别转化烟草.利用由原核表达的GFP-COP1融合蛋白制备的抗体和GFP基因片段制成的放射性探针,通过Southern和免疫印迹实验证实各种外源融合基因在转基因烟草中均获得了组成型的表达.通过系统研究不同光照条件下这些融合蛋白的亚细胞定位的变化和由此导致的转基因烟草的表型变化,发现:（1）烟草内源COP1的分子量为76ku,在各器官组成型存在,光照条件对其含量影响不大.（2）COP1的细胞核定位域在其核-质分配的调节中起着关键作用.含有核定位域的目的蛋白在叶表皮细胞中的亚细胞定位受光调节,而在根细胞则组成型定位于细胞核中.（3）Coiled-coil域对COP1 的功能十分重要,而锌指结构域起辅助作用.（4）WD-40重复结构域起着关键作用,但单独的WD-40重复结构域不影响光形态发生.（5）过量表达COP1不仅导致烟草地上部分光形态发生受抑制,而且还导致短的簇生根发生.相反,过量表达不含WD-40重复结构域的COP1则促进地上部分光形态发生,

摘要：以本实验室构建的含新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因重组质粒为模板,设计引物通过PCR和重叠-延伸PCR扩增,获得HNa、HNb和HNa-L-b三种抗原结构域基因片段,BamHⅠ/HindⅢ双酶切定向克隆到原核表达载体pET32c,获得重组质粒分别命名为pET32c-HNa、pET32c-HNb和pET32c-HNa-L-b。重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,筛选出阳性克隆,诱导表达并取产物进行分析。结果表明,HNa、HNb、HNa-L-b结构域基因片段均获得了融合表达。Western-blotting分析证实表达产物HNa和HNb与NDV阳性血清具有免疫反应性。本试验结果为进一步研究HN蛋白抗原结构域的免疫原性以及HN蛋白与F蛋白在细胞融合中的相互作用奠定了基础。

摘要：为构建c-Jun氨基末端激酶3 (c-Jun N-terminal kinase3,JNK3)的p VP16-eGFP-Myc-JNK3活化环(activation-loop,A-loop)结构域突变型重组质粒,通过A-loop突变型JNK3的c DNA序列以及pVP16-eGFP-Myc的酶切位点设计引物,PCR扩增目的基因,使用限制性内切酶Mlu I与Xba I将基因克隆到pVP16-eGFP-Myc真核表达载体中,构建pVP16-eGFP-Myc-JNK3(A-loop)结构域突变型重组质粒。转化后,通过双酶切鉴定与DNA测序判断是否成功构建重组质粒,使用Trans IntroTM EL Transfection Reagent转染人胚肾(human emborynic kidney,HEK) 293T细胞,通过荧光显微镜下观察融合蛋白表达情况。结果表明:构建pVP16-eGFP-Myc-JNK3 (A-loop)结构域突变型重组质粒,双酶切鉴定和测序结果显示构建成功;pVP16-eGFP-MycJNK3 (A-loop)成功转染HEK293T细胞且表达。鼠源JNK3结构域突变型质粒构建成功,对进一步研究JNK3结构域在相关疾病的作用和机制提供实验工具。

摘要：目的:应用基因芯片技术,对乙型肝炎病毒DNA(HBVDNA)聚合酶P结构域蛋白/逆转录酶(PR)的基因表达谱进行分析,探索PR对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能。方法:设计并合成PR基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增PR蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的PR编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3. 1(-) PR。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3. 1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析。结果:基因芯片技术所检测的1 152个基因表达谱的筛选中, 79条基因表达水平上调, 90条基因表达水平下调。结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HBVDNA聚合酶PR转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明PR蛋白可能的分子生物学机制提供依据。

摘要：为了构建猪源APOBEC3F-N端结构域真核载体,探究APOBEC3F与猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)作用的功能区域,以猪源APOBEC3F-N端结构域为研究对象,根据APOBEC3F蛋白二级结构预测结果设计APOBEC3F-N端结构域引物,以pcDNA3.1(+)5’Flag-APOBEC3F重组质粒为模板进行APOBEC3F-N端结构域PCR扩增,通过无缝克隆技术连接扩增产物至pcDNA3.1(+)5’Flag,构建重组质粒pcDNA3.1(+)5’Flag-APOBEC3F-N,并进行测序鉴定。结果:试验扩增出APOBECF-N端结构域序列,并将该序列连接至pcDNA3.1(+)5’Flag载体,经测序鉴定pcDNA3.1(+)5’Flag-APOBEC3F-N重组质粒构建成功。结论:构建的猪源APOBEC3F-N端结构域真核表达载体可作为研究APOBEC3F与PRRSV相互作用机制的基础。