摘要：目的探讨利用分子生物学方法直接快速检测临床标本结核分支杆菌利福平（ＲＦＰ）药物敏感性的可行性。方法自行设计针对ｒｐｏＢ基因特异扩增的引物（扩增产物为１８３ｂｐ片段），运用聚合酶链反应单链构象多态性（ＰＣＲＳＳＣＰ）银染色法，检测４５株结核分支杆菌临床分离株，对其中部分菌株进行ｒｐｏＢ基因ＤＮＡ序列分析；运用ＰＣＲＳＳＣＰ银染色法对７０份结核病患者痰标本进行直接快速检测，并与药敏试验结果做对照分析。结果４５株临床分离株中１６株ＲＦＰ敏感结核分支杆菌ＳＳＣＰ带谱与结核分支杆菌标准株（Ｈ３７Ｒｖ）相同，２９株ＲＦＰ耐药株中有２６株检测到突变图谱，阳性率为９０％。从具有ＳＳＣＰ特征性带谱的菌株中筛选８株临床分离株进行ｒｐｏＢ基因序列分析显示：１株ＲＦＰ敏感株无ｒｐｏＢ基因突变，７株耐药株均发生碱基突变（符合率１００％）。碱基以单点突变为主，以５３１位碱基突变最为多见［４株５３１位ＴＣＧ→ＴＴＧ，Ｓｅｒ→Ｌｅｕ（５７％）；１株５３１位ＴＣＧ→ＣＡＧ，Ｓｅｒ→Ｇｌｎ（１４％）；２株５２６位ＣＡＣ→ＴＡＣ，Ｈｉｓ→Ｔｙｒ（２９％）］。与ＢＡＣＴＥＣ对照临床痰标本直接快速检测阳性率为６４％。结论结核分支杆菌耐ＲＦＰ?

摘要：目的　建立一种用微通道电泳芯片分析系统检测结核分支杆菌异烟肼耐药基因突变的方法。方法　以丙烯酰胺及其衍生物的聚合物溶液作为筛分介质 ,溶液中掺入微量的吖啶橙作为荧光标记物 ,对结核分支杆菌的异烟肼耐药相关的katG和inhA基因进行单链构象多态性 (SSCP)分析 ,检测其与耐药性相关的突变。对于突变部位附近没有二级结构的inhA基因 ,设计了特别的引物使扩增产物增加一个能与突变部位配对的区域 ,从而使野生型片段呈现独特的构象。结果　此方法可实现对katG基因野生型片段与 315位密码子突变型片段的区分 ,以及对inhA基因调节序列野生型与突变型片段的区分。 30个临床分离株中的 2 3个耐药株有 2 2个被检出 ,效率达 95 %。结论　微通道电泳方法用于结核杆菌耐药基因突变检测 ,具有快速、灵敏的优点 ,可望将之应用于临床耐药性检测。

摘要：目的　构建能表达结核分支杆菌热休克蛋白 6 5kD的工程菌。方法　设计引物并PCR扩增 ,目的基因克隆并转化 ,重组子经酶切和自动测序鉴定 ,阳性重组子转化表达宿主菌并受化学诱导后表达重组 6 5kD蛋白。结果　 6 5kD蛋白编码基因约 1.6kb ,重组子单酶切和双酶切证明目的基因插入载体 ,3个测序反应覆盖 99.1%目的基因 ;大肠杆菌表达重组 6 5kD蛋白。结论　大肠杆菌表达系统是一种快速、简便获得单一结核分支杆菌抗原的途径。

摘要：目的探讨异烟肼（ＩＮＨ）耐药与结核分支杆菌ｋａｔＧ基因突变的关系。方法用ｋａｔＧ基因５′端设计的引物对４６株结核分支杆菌临床分离株（含４株耐药诱导株，下同）进行了聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增，并对ＰＣＲ产物进行单链构象多态性（ＳＳＣＰ）分析。结果４６株结核分支杆菌临床分离株均未发现ｋａｔＧ基因序列的缺失。对其ＰＣＲ产物进行ＳＳＣＰ分析后发现，１６株ＩＮＨ敏感株均未检测到ｋａｔＧ基因突变；３０株ＩＮＨ耐药株中，１７株检测到ｋａｔＧ基因突变，耐药株中ｋａｔＧ基因突变率为５７％。结论证实ｋａｔＧ基因突变是ＩＮＨ耐药的重要机制之一。

摘要：目的　研制一种新型DNA芯片 ,用于结核分支杆菌对利福平的耐药性快速检测。方法　根据结核分支杆菌rpoB基因的序列信息设计探针并制作DNA芯片 ,PCR扩增并荧光标记包含结核分支杆菌rpoB基因突变热点的目的片段 ,与芯片杂交 ,同时以DNA测序法为对照。结果　 17株随机抽取的耐利福平结核分支杆菌菌株有 14株可用DNA芯片检测出来 ,效率可达 83%;患者痰液中少量的DNA足够进行芯片检测 ,无须进行培养。结论　用DNA芯片来检测结核分支杆菌对利福平的耐药性具有较高的特异性和灵敏度 ,该法快速、精确 。

摘要：目的探讨用低密度核苷酸薄膜导流杂交技术快速检测结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的可行性。方法根据MTB rpoB基因设计12个野生型及常见突变型寡核苷酸特异探针,制作低密度核苷酸薄膜微阵列,通过导流杂交技术与薄膜杂交鉴定,并与DNA测序法对比。结果 81株MTB的耐药性试验及DNA测序结果显示,27株耐利福平MTB株中20株(74.1%)存在突变。以DNA测序结果为标准,31株标本(20株耐利福平MTB突变株,11株利福平敏感MTB野生株)低密度核苷酸薄膜导流杂交的敏感性为85%(17/20),特异性为100%(11/11),阳性预测值为100%(17/17),阴性预测值为78.6%(11/14);与DNA测序法的符合率为90.3%(28/31)。结论用低密度核苷酸薄膜导流杂交能快速、简便检测MTB,并可提示其是否对利福平耐药,指导临床合理用药。

摘要：目的　探讨快速检测rpoB基因突变的敏感方法 ,以期建立适合我国国情的结核分支杆菌耐药株的快速检测手段。方法　根据结核分支杆菌野生株序列 ,自行设计覆盖rpoB基因核心突变区的系列寡核苷酸探针并将其固定在尼龙膜上 ,然后应用生物素标记的特异性引物扩增包含核心突变区的rpoB基因片段 ,与固定在膜上的寡核苷酸探针杂交 ,对突变位点进行快速检测 ,并与药敏试验及DNA测序结果进行比较。结果　应用反向斑点杂交法检测 36株耐药株和 2 2株敏感株rpoB基因的突变位点 ,并据此判断其对利福平的药敏特性 ,结果敏感性为 88.9% ,特异性为 86 .4 % ,药敏结果符合率为 87.9% ,与测序结果的符合率为 89.7%。结论　反向斑点杂交法可以快速、敏感地检测rpoB基因突变 ,进而早期判断结核分支杆菌对利福平的药敏特性。

摘要：目的研究结核分支杆菌分子信标探针荧光芯片的固定方式。方法通过对传统生物素(biotin)-亲和素(avidin)连接方式和自行设计的单侧延长臂的分子信标连接方式的对比研究,对TB分子信标与芯片固定方式进行探索。结果生物素-亲和素(biotin-avidin)能很好地结合在芯片上但这种修饰有相当技术难度;且生物素-亲和素连接无特异性。本设计单侧延长臂分子信标采用淬灭分子中间标记,茎结构单侧(淬灭分子一侧)延长臂,能很好的结合在芯片上,且修饰技术难度低、特异性高。结论单侧延长臂分子信标探针设计的发明及运用,初步解决了分子信标技术在芯片技术领域运用的固定难题。巧妙地把分子信标高特异性、高灵敏性等优势自然运用到芯片技术上。

摘要：应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分支杆菌对乙胺丁醇 (EMB)耐药性。设计与合成用于检测结核分支杆菌耐EMB基因embB的寡核苷酸探针 ,点于硝酸纤维素膜上 ,与结核分支杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应 (PCR)产物进行反向斑点杂交 ,并与PCR 单链构象多态性 (PCR SSCP)和PCR 直接测序 (PCR DS)结果比较。对 81株结核分支杆菌临床分离株进行分析 ,31株EMB敏感株中 ,2 6株embB基因的SSCP图谱、膜反向斑点杂交结果与标准株 (H37Rv)完全相同 ;其余 5株SSCP图谱出现泳动变位 ,其中 3株E1b杂交阳性 ,PCR DS分析为embB基因 30 6位密码子ATG→GTG突变 ;2株E1d杂交阳性 ,PCR DS分析为embB基因 30 6位密码子ATG→ATA突变。 5 0株耐EMB菌株中 ,2 4株PCR SSCP图谱与标准菌株相同 ,E1杂交阳性 ;2 6株PCR SSCP图谱出现泳动变位 ,其中 18株E1b杂交阳性 ,2株E1c杂交阳性 ,5株E1d杂交阳性 ,1株E1e杂交阳性 ,未发现E1f杂交阳性 ,与PCR SSCP、PCR DS分析结果一致。突变检出率为 5 2 %。膜反向斑点杂交技术可能成为检测部分结核分支杆菌乙胺丁醇耐药基因型简便、快速的方法。

摘要：目的应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分支杆菌对异烟肼(INH)耐药性。方法设计与合成用于检测结核分支杆菌耐INHkat、inhA基因的寡核苷酸探针,点于硝酸纤维素膜上,与结核分枝杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应(PCR)产物进行反向斑点杂交。结果20株INH敏感株中,仅9例出现野生型探针K1阳性杂交,余11株中,10株K1b'杂交阳性,PCR-DS显示KatG基因315位密码子AGC→ACC,1株K1c'杂交阳性,PCR-DS显示KatG基因315位密码子AGC→ACC;15株出现野生型探针inh1阳性杂交,另5株Inhal探针杂交阳性,PCR-DS显示inhA基因-15位C→T突变。36株耐药株中,17株K1探针杂交阳性,18株K1b'杂交阳性,1株与所试探针不杂交,PCR-DS显示KatG基因279位密码子GGC→GAC;11株与突变型Inhal探针阳性杂交,25株野生型探针inhl杂交阳性。KatG基因膜杂交突变检出率为50%,inhA基因膜杂交突变检出率为30.56%。结论膜反向斑点杂交技术可成为检测部分结核分支杆菌耐异烟肼基因型简便、快速的方法。