摘要：旨在获得肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因沉默的成纤维细胞系,为进一步探索Myostatin的调控机理,获得Myostatin的基因沉默的转基因羊奠定基础。针对小尾寒羊Myostatin的基因序列,设计4条siRNA干扰序列,构建pSilencer干扰载体,转染成纤维细胞,采用RT-PCR进行筛选;构建慢病毒干扰载体,包装病毒,感染成纤维细胞,采用流式细胞技术分选阳性细胞,阳性细胞予以测序鉴定并检测沉默效果。结果,获得Myostatin基因沉默效率约90%的RNA干扰片段PSL1,包装病毒获得滴度为1×108的病毒颗粒,流式细胞技术分选得到纯度达99%的Myostatin基因沉默成纤维细胞系。采用慢病毒感染接合流式细胞术分选,能较快获得无抗性标记的转基因阳性细胞系,为培育Myostatin基因沉默的转基因羊及探索Myostatin的调控机理奠定基础。

摘要：为了筛选转pK2.10-拟蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊成纤维细胞株,本研究参照GenBank上蜘蛛拖丝蛋白基因序列(AY555585和AH015065)设计并人工合成拟蜘蛛基因四聚体(4S),与pcDNA3.1载体(K2.10启动子)相连构建真核表达载体(pcDNA3.1-K2.10-4S),采用脂质体介导法转染绵羊成纤维细胞,通过药物筛选、阳性细胞鉴定及体外培养等方法,获得了转蜘蛛拖丝蛋白基因的绵羊成纤维细胞株。结果,用pcDNA3.1-K2.10-4S表达载体转染冷冻复苏的绵羊成纤维细胞后,利用G418筛选法获得neo基因的抗性细胞,即阳性细胞;采用PCR方法对阳性细胞鉴定显示,所构建的载体整合到了细胞基因组中;对阳性细胞的染色体核型分析显示,阳性细胞核型稳定,与正常细胞的核型无差异;阳性细胞经冷冻复苏后仍能保持原有的特性。该细胞株的建立为进一步开展转拟蜘蛛拖丝蛋白基因的克隆羊研究奠定了基础。

摘要：针对绵羊β-酪蛋白基因启动子序列设计4个人工转录因子TALE-TFs。电转染TALE-TFs进入绵羊成纤维细胞中，通过实时荧光定量和Western blotting检测β-酪蛋白基因表达，筛选获得激活效果较好的TALE-TF1。将TALE-TF1和β-酪蛋白基因启动子、Red报告基因质粒电转染进入绵羊成纤维细胞，通过荧光显微镜直接观察报告基因Red表达。利用TALE人工转录因子，在绵羊成纤维细胞中能够激活β-酪蛋白基因启动子表达框，为替代乳腺上皮细胞表达验证系统提供了一种检测途径。