摘要：根据选择的靶基因RPO35基因序列,使用Oligo 7软件设计并筛选合适的引物与探针,在37℃下通过反应时间和反应体系的优化,结合胶体金试纸条检测,建立了一种检测绵羊痘病毒/山羊痘病毒的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)方法,对其敏感性和重复性进行了检验,并将其用于临床样品的检测,将检测结果与普通PCR检测结果进行了比较。试验结果显示,病毒核酸阳性样品能够在试纸条上显示出阳性条带,阴性样品不显示,试验具有良好的重复性、敏感性(达到620 fg/μL),与普通PCR方法相当。使用本方法,对PCR方法确定的绵羊痘病毒核酸阳性的5份样品和随机抽取的5份临床样品进行了检测,结果显示,绵羊痘病毒核酸阳性的5份样品全部为阳性;5份临床样品中1份为阳性,4份为阴性,检测结果与普通PCR检测结果完全(100%)符合。上述结果表明,本研究建立的RPA技术适用于绵羊痘病毒/山羊痘病毒的快速检测,为绵羊痘和山羊痘的临床诊断提供了新的选择。

摘要：为建立鉴别绵羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒(GTPV)的检测方法,本研究针对这2种病毒的基因组序列,分别设计2对特异性引物,通过对引物浓度、退火温度等的优化,建立了快速鉴别检测SPPV和GTPV的双重PCR方法。该方法分别扩增出SPPV长度为177 bp和GTPV长度为222 bp的目的片段。特异性试验结果显示,该方法对牛疙瘩皮肤病病毒、犬细小病毒、大肠杆菌O157、沙门氏菌、健康羊组织和牛组织均无扩增。敏感性试验显示,该方法最低可检测1.725×107copies/μL的SPPV和1.71×106copies/μL的GTPV。应用该方法对50份临床病料样品进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致,均检出5份感染GTPV的病料和2份感染SPPV的病料,表明该方法可以用于临床病料样品的检测。

摘要：从华东感染的绵羊中分离到一株病毒，命名为HB株。根据已发表的绵羊痘病毒的基因序列设计了一对引物，采用PCR方法从病毒HB株总DNA中扩增出与预期大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆人pMD-18T载体中，经Amp和蓝白斑筛选和PCR鉴定后，对阳性克隆株进行了序列测定和序列分析。扩增所得的HB株的基因片段与已发表的绵羊痘病毒毒株的相应基因片段具有高度同源性，同源性在99．5％-100％。研究结果证实分离毒株为绵羊痘病毒。

摘要：为建立快速检测绵羊痘病毒(SPPV)快速检测方法基因的方法,本研究参照SPPV ORF068基因设计并合成一对特异性引物和一条MGB探针,经条件优化,建立了SPPV TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测方法。结果显示,该方法可以特异性检测SPPV,而对羊口疮病毒和猪水疱病病毒等扩增结果均为阴性;而且检出下限为10拷贝/μL;组内组间重复性试验的变异系数均小于3%。上述结果显示本研究建立的TaqMan-MGB qPCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,能够对SPPV进行快速准确的检测。

摘要：为建立一种快速、敏感鉴别诊断绵羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒(G TPV)的方法,本研究根据SPPV和GTPV基因组保守区,分别设计特异性引物和探针,建立了SPPV和GTPV实时荧光RPA (real-time fluorescent recombinase polymerase amplification)检测方法。结果显示,该方法仅对SPPV和GTPV的靶基因扩增呈阳性,而对牛结节性皮肤病病毒(LSDV)、传染性脓疱病毒(O RFV)、蓝舌病病毒(BTV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、水疱性口炎病毒(VSV)、A型口蹄疫病毒(FM DV type A)、O型口蹄疫病毒(FMDV type O)、亚洲1型口蹄疫病毒(FMDV Asia 1)等相关病毒检测结果均为阴性,特异性良好;对SPPV和GTPV检测的灵敏度分别为4.72×10~2copies/μL和4.35×10~2 copies/μL;利用该方法对临床样品进行检测,与OIE推荐的普通PCR检测结果符合率为100%。结果表明,建立的SPPV和GTPV实时荧光RPA方法灵敏、快速、特异性强,为SPPV和GTPV感染的早期诊断提供了技术支持,适用于SPPV和GTPV的检疫、疫情监测及流行病学调查,对疫情暴发后相应控制方案的制定具有重要意义。

摘要：利用羔羊睾丸细胞、Marc-145、Vero细胞对病毒进行分离和培养,通过动物回归试验、组织病理学切片的观察、透射电镜观察、PCR鉴定等方法进行病毒的鉴定,并参照GenBank中绵羊痘病毒P32基因序列设计并合成1对特异性引物,成功地对分离株的P32基因进行克隆、测序,并与多株参考毒株进行同源性比对分析。结果显示：透射电镜下观察到典型的痘病毒粒子;动物回归试验中试验动物临床症状为典型的羊痘症状;组织病理学切片中观察到羊痘病毒嗜酸性包涵体;通过DNASTAR与参考毒株进行同源性比对,与参考株同源性为97.2%~99.5%。结果表明：该分离株为绵羊痘病毒,并命名为SPPV-NeiMengG2015。

摘要：为了建立山羊痘病毒(Goat pox virus,GTPV)和绵羊痘病毒(Sheep pox virus,SPPV)快速荧光PCR检测方法,本研究对2种病毒的保守基因P32基因在GeneBank上进行Blast比对,设计合成特异性荧光PCR引物和探针,构建了该病原特异性基因P32的重组质粒。建立了可以同时检测山羊痘病毒和绵羊痘病毒荧光PCR方法,对方法的特异性、敏感性和重复性进行研究,结果显示该方法具有高度的特异性,除了识别山羊痘病毒和绵羊痘病毒基因组外,对羊的基因组及山羊和绵羊常见病原的基因组均不发生交叉反应。在敏感性和重复性实验中,该方法对山羊痘病毒和绵羊痘病毒的检测限为1000Copies·mL-1,变异系数小于3%,因此具有优良的敏感性和稳定性。用该方法检测实验室模拟制备的样品,检测结果与预期相符合。

摘要：山羊痘和绵羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。为了更快、更准确的诊断该病,本研究根据Gen Bank已经发表的GTPV和SPPV参考毒株(登录号分别为AY077836和AY077832)A29L基因序列,设计合成了1对特异性引物和2条Taq Man探针,同时制备重组质粒标准品。经过反应条件的优化,建立了羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的实时荧光定量PCR方法反应体系的特异性、灵敏性和重复性进行了评价,并用此方法对19份临床样品进行了检测。结果显示:该诊断方法与4种非羊痘病毒不发生交叉反应,并且山羊痘病毒和绵羊痘病毒之间也不发生交叉反应。该方法的重复性试验变异系数均低于2%,并且双重实时荧光定量PCR最低浓度检测限分别为470和440 fg。对标准阳性模板进行定量检测,生成的标准曲线相关系数分别为0.995和0.997。在检测的临床样品中,GTPV和SPPV阳性分别有14和4份,混合感染有1份。结果表明所建立的方法具有良好的特异性,灵敏性、稳定性,可以对GTPV和SPPV进行准确的定量检测。

摘要：为建立羊痘病毒(CaPV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究根据GenBank中羊痘病毒的保守基因序列,设计出针对羊痘病毒的LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪优化得到病毒核酸等温扩增最佳条件是62℃恒温反应60min。在此条件下,病毒核酸的最低检测含量为3.1×10-2 pg/μL,灵敏度比OIE推荐的PCR方法高104倍。添加钙黄绿素(calcein)建立的目测法,还可实现对上述病原体检测结果肉眼观察。本研究获得的CaPV LAMP仪器法和目测法可特异性地扩增羊痘病毒属的山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒核酸,具有反应快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、设备要求低等特点。

摘要：根据羊传染性脓疱病毒F1L基因序列设计3条引物,建立了一种能鉴别诊断羊传染性脓疱病毒和绵羊痘病毒、山羊痘病毒的半套式PCR快速检测方法。采用该方法对羊传染脓疱病毒XC13株进行检测,结果半套式PCR扩增出450bp的特异性DNA片段,而对山羊痘病毒、绵羊痘病毒、禽痘病毒的扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,所建立的PCR方法能检出3.64×101 copies/μL羊传染性脓疱病毒;重复性试验、临床样品检测试验结果表明,所建立的半套式PCR检测方法可用于羊传染性脓疱病毒感染的快速诊断与流行病学调查。