摘要：为实现对外源性绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV)的快速检测,根据基因组中序列保守的env基因设计特异性引物和探针,通过优化反应条件和反应体系,建立了exJSRV的实时荧光RPA检测方法,并通过灵敏度、特异性、重复性及样品检测进行评价。结果显示,该方法最佳反应温度为40℃,用时短,仅需20 min即可完成扩增;灵敏度高,最低可检测到10^(6)ng/L的cDNA模板,纯化后的cDNA模板最低可检测到10 ng/L,与PCR结果一致;特异性强,能准确检测到exJSRV,与小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊败血性链球菌(OSS)、牛肠道病毒(BEV)、传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、肺炎支原体(MO)等继发呼吸道症状的病原无交叉反应;重复性好,对于相同质量浓度的模板cDNA检测结果一致;可有效检测出病羊肺组织、鼻液及外周血白细胞内的exJSRV,与PCR结果一致。结果表明,该方法可实现exJSRV的快速检测,为绵羊肺腺瘤病(OPA)的诊断及防控提供可靠依据。

摘要：　　根据绵羊肺腺瘤病毒(SJRV) NM株基因组全序列,设计了 1 对包含囊膜(env)基因在内的引物,并在5′端分别设计了HindⅢ和 BamHⅠ酶切位点,利用 PCR技术扩增 env基因,通过连接反应将其克隆于pET 30b表达载体上。序列分析表明,env基因全长 1 836 bp,编码 612 个氨基酸残基;构建表达重组质粒env pET 30b,转化大肠埃希氏菌 BL21,经 IPTG于 37 ℃诱导培养,SDS PAGE电泳分析表明,表达的env基因融合蛋白分子质量约为69 ku。

摘要：本研究参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的基因组全序列,设计合成8对引物,从内蒙古某羊场自然感染绵羊肺腺瘤病的病肺肿瘤组织中提取总DNA为模板,对JSRV-NM株基因组分8段进行PCR扩增,产物分别为8个(531bp,888bp,949bp,944bp,1428bp,947bp,1836bp,538bp)基因片段,将其分别克隆入pMD-18T载体中进行双向测序并拼接序列,获得完整的JSRV-NM株前病毒基因组全序列。结果表明,JSRV-NM株前病毒基因组全长7430bp,有相互重叠的4个较长的开放阅读框(ORF),分别代表gag、pro、pol和env基因。与绵羊肺腺瘤病毒Ⅰ型即南非代表株(NC-001494)和绵羊肺腺瘤病毒Ⅱ型即美国代表株(AF105220)的核苷酸同源性比较分别为90.4%和90%,推导出的氨基酸同源性分别为90%和89.1%。分析JSRV-NM株基因组结构,发现在LTR的上游和下游都具有外源性exJSRV特有的ScaⅠ酶切位点,在gag基因编码的NC区发现有2个较典型的“胱氨酸—组氨酸序列”,可形成锌指结构。在env基因编码的TM区有特异性的“YXXM”基序。用地高辛标记外源性exJSRV特异的JSRV-2片段制成探针,原位杂交法检测自然感染绵羊肺腺瘤病(OPA)的病肺组织中JSRV-NM的RNA及前病毒DNA,结果表明OPA患羊肺肿瘤细胞的胞浆和核内都有JSRV-2基因mRNA的表达,说明JSRV-NM株是具有致瘤作用的外源性反转录病毒。这是我国首次报道的绵羊肺腺瘤病毒的基因组全序列。

摘要：目的为能够更加准确、敏感的检测绵羊肺腺瘤病(sheep pulmonary adenomatosis SPA)。方法本试验通过外源性绵羊肺腺瘤病毒的囊膜基因env的TM区和长末端重复序列LTR的U3区分别设计特异性的内外侧引物,运用巢式RT-PCR的方法进行检测,同时与普通RT-PCR进行比较。结果测得的绵羊肺腺瘤病毒的env基因和U3区序列与Gen-Bank中发表的外源性绵羊肺腺瘤病毒基因序列(AF105220)同源性分别为100%和98%。特异性试验结果表明本试验设计的env基因和LTR的U3区的内外侧引物不能从健康绵羊、小鼠、家兔的肺组织以及感染了SPA羊的肾、肝、脾的RNA中扩增出条带。敏感性试验结果表明,env基因和LTR的U3区的巢式RT-PCR诊断方法最低能检测出的标准模板RNA量分别为48 fg和48 pg,而普通的RT-PCR,env基因及LTR的U3区的最低检出量分别为0.48 ng和4.8 ng,得出巢式RT-PCR的敏感性高于普通RT-PCR,同时env基因的敏感性高于LTR的U3区的敏感性。结论以上试验说明巢式RT-PCR技术对于检测绵羊肺腺瘤病具有很高的敏感性和实用性。

摘要：根据GenBank登录的绵羊肺腺瘤病毒gag基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出了276bp的片段。产物经回收与pMD18-T Vector连接后转化到基因工程菌DH5a中,提取重组质粒,经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性试验、特异性试验、重复性试验和临床检测应用。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,产物Tm在82～82.5℃之间,灵敏度为2.22个拷贝/μL,特异性和重复性较好,较常规RT-PCR方法提前1h出检测结果。本试验建立了检测JSRV的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法,为该病的早期快速诊断,并定量分析JSRV感染程度奠定了基础。

摘要：为建立绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据JSRV的gag基因,选取其保守序列作为检测目的片段,设计并合成相应的引物和TaqM an探针,以自然病例的肺肿瘤组织基因组DNA为模板,经PCR扩增目的基因构建重组质粒pMD-gag,并将其作为阳性标准品,梯度稀释建立标准曲线,得到扩增方程为:y=-0.304x+38.4,扩增效率为100%,线性相关系数为0.999,该方法最低检出量为103拷贝,与其它病原核酸样品无交叉反应,其变异系数在1.374%以内。本研究为快速检测JSRV以及组装检测试剂盒奠定了基础。

摘要：绵羊肺腺瘤病(OPA)于1850年发现,但国内外至今尚未建立绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)的体外培养方法及快速有效的实验室检测方法。为表达JSRV的衣壳蛋白(CA)基因,本研究根据JSRV CA基因编码序列设计特异性引物进行PCR扩增,克隆至pEASY载体中进行测序,并构建重组表达质粒pET-CA,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达。重组蛋白经SDS-PAGE检测约为28 ku,主要以可溶形式表达。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔,制备抗血清。以制备的抗血清对重组蛋白及病毒进行western blot鉴定。结果显示,该抗血清能够识别重组蛋白及天然的JSRV。本研究首次原核表达了完整的CA重组蛋白,并制备了能够与天然JSRV结合的抗CA蛋白的抗血清,为进一步建立JSRV ELISA方法奠定了基础。

摘要：根据GenBank中的绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)基因组序列,应用Oligo6.0软件设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为467bp,内部引物的扩增片段大小为214bp,建立了一种快速检测JSRV的套式RT-PCR检测方法。试验结果显示,该检测方法与同属的几种绵羊易感的病毒均无交叉反应,比普通RT-PCR方法敏感性高,具有重复性好、特异性强、敏感性高等优点,可以准确快速地检测出极低含量的JSRV病原,为绵羊肺腺瘤病的快速诊断、净化及深入研究奠定了基础。

摘要：究参照Genebank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的全基因序列,设计合成一对引物,对JSRV中国NM株的gag基因3'端中主要编码核衣壳(NC)蛋白的基因段进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现一条约951bp的特异条带,将其回收后克隆入pMD＿18T载体中,并进行序列测定。结果表明,与南非代表株(基因序列号NC＿001494)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为95 4%,推导出的氨基酸同源性为95%。与美国代表株(基因序列号AF105220)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为91 3%,氨基酸同源性为91%。这是我国首次报道的绵羊肺腺瘤病毒的gag基因的一段序列,为我国科研工作者进行更深入的研究奠定基础。

摘要：为建立检测绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)方法,根据外源性JSRV-NM株env基因序列,选其保守序列作为目的片段,设计引物和TaqMan探针,以自然病例的肺肿瘤组织基因组DNA为模板,经PCR扩增目的基因、克隆,重组质粒鉴定,并严格定量后,梯度稀释作为阳性标准品,优化反应条件进行Real-time qPCR扩增,获得的标准曲线为:Y=-3.308X+47.848,线性相关系数为0.991;Ct值变异系数小,并且灵敏度高,初步建立了检测JSRV前病毒DNA的Real-time qPCR方法。应用该方法对不同来源(A、B、C、D、E组)的绵羊外周血及其他组织样品进行测定其前病毒载量。结果显示B组和C组外周血白细胞、肺脏、肺门淋巴结以及鼻液中检测均为阳性,并发现前病毒DNA的载量在肺脏中明显高于外周血白细胞;D组虽未发现有绵羊肺腺瘤(SPA)临床症状,但在肺门淋巴结里可以检测到;E组中1只绵羊的肺脏也检出低拷贝数的前病毒DNA,而在A组中检测结果均为阴性。本研究对检测未知羊群JSRV感染程度及研究SPA流行病学等均有重要意义。