摘要：目的　了解上海华山医院临床分离大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中产生的超广谱 β 内酰胺酶 (ESBL)的基因型及其流行情况。方法　双纸片法和美国国家临床实验室标准委员会 (NCCLS)表型确定实验检测产ESBL菌株并对产ESBL菌株进行接合实验 ;提取产ESBL菌株及其转移接合子中的质粒 ,进行电泳分析 ;采用琼脂稀释法 ,测定各种菌株对多种抗菌药物的敏感性 ;TEM、SHV、CTX M 1组、CTX M 13组、Toho 1组通用引物检测产ESBL菌株及其转移接合子 ;编码框以外设计引物、聚合酶链反应 (PCR)扩增转移接合子中的CTX M 13组全编码基因 ,克隆入 pHSG398质粒、表达 ,并对PCR产物进行测序 ,分析其基因型 ;对这些产ESBL菌株进行脉冲场电泳 (PFGE)检测。结果　产ESBL菌株对多种 β 内酰胺类和非 β 内酰胺类抗生素耐药 ;产ESBL菌株可通过接合转移方式传递其耐药性 ,转移频率多为 10 -4～ 10 -5,多数非 β 内酰胺类抗生素的耐药性可以和ESBL耐药性发生共转移 ,琼脂糖电泳显示接合子从供体菌得到了一个 >2 3 1kb的质粒 ;转移接合子中仅CTX M 13组通用引物检测为阳性 ;4株转移接合子中CTX M 13组全编码基因序列与CTX M 14编码基因序列的同源性为 10 0 % ,其余 6株转移接合子中CTX M 13组全编码基因序列与CTX M 2

摘要：根据日本血吸虫菲律宾株编码 2 1 7kD蛋白的基因设计引物 ,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板 ,用RT PCR法扩增出大小为 5 5 8bp的基因片段。经序列分析推断该基因片段为编码日本血吸虫中国大陆株2 1 7kD蛋白基因的完整阅读框 ,与菲律宾株该基因的碱基序列同源性为 98%。将其克隆到表达载体pET2 8a(+)中 ,在大肠杆菌BL2 1中获得表达 ,融合表达产物分子量约为 2 5 4kD。利用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对该表达产物进行Western印迹检测 ,在预测位置出现了明显的识别条带 。

摘要：纯化了橄榄绿链霉菌Al产生的胞外木聚糖酶XYNB,并对其酶学性质进行了测定,XYNB具有优良的酶学性质,最适pH为5.2,最适温度为60℃,比活性高达2869.78 U/mg,对金属离子及EDTA和SDS等具有较好的抗性,根据木聚糖酶成熟蛋白N端氨基酸序列测序结果设计引物,克隆了此酶的成熟蛋白编码基因xynB,基因全长576 bp,(G+C)含量为64.3％,编码191个氦基酸,理论分子量为20.839kD,是一种新的木聚糖酶基因.构建了xynB表达载体并在大肠杆菌中得到了表达,表达产物具有正常的生物学活性.

摘要：目的构建小鼠白细胞介素-12的融合基因,并进行初号表达。方法通过重叠序列引物的设计与多聚酶链反应(PCR)技术,将小鼠IL-12的40kDa多肽链基因与35kDa多肽链基因,以甘氨酸接头(Gly4Ser)3序列连接成为融合蛋白编码基因,构建融合蛋白表达载体,转染小鼠成纤维细胞SVT2,表达具有生物学活性的融合蛋白型IL-12。结果构建的小鼠IL-12表达载体经测序无突变发生。以G418筛选转染的SVT2细胞,获得数十个抗性细胞克隆,测定其IL-12生物学活性,分泌量达52.1～112.6pg/ml。表达的融合型小鼠IL-12具有生物学活性。

摘要：根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR从含有PCV-2的PK-15细胞中扩增出ORF2基因,将其克隆入pSecTag2载体中,构建了pSecORF2载体。又设计一条含信号肽序列的上游引物,以pSecORF2为模板,扩增出含信号肽序列的ORF2基因,将其克隆到pIREShyg载体上,构建了pIRESiORF2真核表达载体。然后通过磷酸钙共沉淀法转染CHO细胞,进行表达。间接免疫荧光实验(IFA)成功检测到pIRESiORF2在CHO细胞中的表达。这为进一步研究ORF2编码蛋白的生物学活性及建立PCV诊断试剂盒打下基础。

摘要：目的　识别和克隆日本血吸虫新基因。方法　对本实验室获得的EST进行同源性分析 ,识别血吸虫新基因 ;根据EST设计引物 ,用锚着PCR法从cDNA文库中扩增出新基因全长cDNA ,并将其克隆入原核表达载体 pGEX - 4T - 1,用生物信息学技术对获得的编码基因进行结构与功能的分析。结果　EST同源性分析得到一个完整编码基因 ,开放阅读框(ORF) 4 95bp ,编码 16 4个氨基酸 ;锚着PCR法获得另一EST的 3’端所缺序列 ,得到完整编码阅读框 ,其ORF 999bp ,编码 332个氨基酸。利用生物信息学技术确定它们分别为日本血吸虫亲环素A(CyPA)和乳酸脱氢酶 (LDH)的编码基因。重组质粒经双酶切及测序鉴定证明日本血吸虫CyPA和LDH原核表达质粒构建成功。 结论　克隆到日本血吸虫亲环素A和乳酸脱氢酶编码基因的全长cDNA 。

摘要：目的:乙型肝炎病毒(HBV)基因组内部结构基因与编码基因之间相互重叠,是基因组序列高度集中利用的一个典型。早期研究中确定了编码病毒蛋白的4个开放读码框架(ORF),本研究通过对于中国HBV感染者的流行病毒株的基因序列进行分析比较,阐明基因组结构的特点,并探索是否存在新型ORF的可能性。方法:考虑到HBV基因组序列的准种特点以及多聚酶链反应(PCR)技术的精确度,我们采用的技术是长距离且精确PCR(LA-PCR)技术,根据中国HBV患者的病毒基因序列设计PCR扩增用引物,自慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBV基因组序列,克隆入pGEM Teasy质粒,挑选克隆进行全基因组DNA测序,与其他HBV基因组序列进行比较。结果:测序结果5株HBV全基因组核苷酸序列存在一新的ORF,定义为前-前-S区,并发现该区之前存在一TA富集区,提示存在新型启动子的可能性。新界定的前-前-S区ORF编码氨基酸序列为MQLIITSKLGIIYILCGRLVFYIREKLHAVPHFVGHHILGNKSYS,与前-S1、前-S2和表面抗原主蛋白编码基因框架一致表达。结论:在HBV基因组中存在有一新的ORF,命名为前-前-S区。

摘要：目的：体外扩增恶性疟原虫海南分离株的已糖转运体基因(PfHT1)，并将该基因克隆至pEGFF真核表达载体内使其高效表达，为研究DNA疫苗创造条件。方法：特定PCR引物的设计；恶性疟原虫FCC1／HN株的体外培养；提取基因组DNA；PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析；酶切、连接及PCR分析鉴定。结果：从恶性疟原虫簿南分离株基因组DNA中扩增出特异性的编码FfhTl的基因序列．片段太小为1516bp，克隆鉴定结果表明插人片段大小正确。结论：体外成功扩增出恶性疟原虫PfHTl编码序列，与预期长度相符，并成功构建pEGFF-Htl真核表达载体。为研究其结构、功能和免疫原性奠定基础，

摘要：目的　获取淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因 (porB)并构建其重组表达质粒。　方法　根据porB已知序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从淋病奈瑟菌基因组DNA中扩增出 porB基因片段 ,克隆到原核表达质粒 pQE3 0中 ,转化大肠埃希菌M15感受态细胞 ,经酶切和PCR鉴定 ,然后进行测序。　结果　porB基因体外扩增产物大小约为 911bp。重组质粒经双酶切和PCR鉴定表明为正确重组子 ,测序结果与已知序列基本吻合。　结论　成功克隆了淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因 ,为下一步PorB蛋白的功能研究和淋病奈瑟菌蛋白质疫苗的研制提供了基本的物质基础。

摘要：目的构建人整合素β3亚基金读码框(ORF)基因真核表达载体,为探讨整合索β3作为汉坦病毒(Hantavirus,HV)受体的特异性奠定基础。方法根据已公布的序列设计引物,用PCR方法从原核质粒中扩增出人整合素分子β3亚基ORF基因,应用TA克隆将其插入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中,采用酶切和PCR鉴定,选取初筛正向插入的阳性克隆进行测序。结果序列分析表明与基因库中已发布的人整合素β3亚基ORF核苷酸序列基本一致,成功构建了pcDNA3.1-β3真核表达载体。结论上述结果表明,真核表达载体pcDNA3.1-β3已被成功构建,并为进一步研究汉坦病毒的病原学及生物学特征提供了基础。