摘要：目的体外条件下模拟缺氧环境，探讨P311和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）相互作用及对小鼠表皮干细胞（ESC）迁移影响。方法取15只C57BL/6J野生型新生小鼠，5只同属来源P311基因敲除新生小鼠，分离培养2种小鼠ESC，取第1代细胞行形态学观察，采用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD71、CD49f表达后行以下实验。（1）取2种小鼠ESC划痕处理后，立即按随机数字表法（下同）将P311基因敲除小鼠ESC分为常氧组（将细胞加入完全培养基置于常氧二氧化碳培养箱培养，常氧处理下同）和缺氧组（将细胞置于含体积分数1%氧气的缺氧二氧化碳培养箱培养，缺氧处理下同），每组12个插件；将野生型小鼠ESC分为常氧组、单纯缺氧组、二甲基亚砜（DMSO）对照组（用2 μL DMSO溶剂常氧处理1 h后行缺氧培养）、HIF-1α抑制剂组（加入11 μmol/L HIF-1抑制剂2 μL常氧培养1 h后行缺氧培养）、HIF-1α稳定剂组（加入2 μmol/L FG-4592 2 μL常氧处理1 h后行缺氧培养），每组12个插件。每组各时相点取3个插件分别于划痕后0（即刻）、12 、24、48 h在100倍倒置相差显微镜下测量划痕剩余宽度。（2）取野生型小鼠ESC行缺氧培养，蛋白质印迹法检测缺氧0（即刻）、12、24、48 h HIF-1α蛋白表达。（3）取野生型小鼠ESC同实验（1）分为单纯缺氧组、DMSO对照组、HIF-1α抑制剂组、HIF-1α稳定剂组并行相应处理，分别在缺氧0、12、24、48 h采用实时荧光定量RT-PCR法检测P311 mRNA表达，免疫细胞化学染色法观测P311表达（样本数均为12）。（4）取第2代人胚胎肾293（HEK-293）细胞分为空载缺氧组（转染空载质粒后进行缺氧培养）、P311常氧组（转染P311报告基因质粒后进行常氧培养）、P311缺氧组（转染P311报告基因质粒后进行缺氧培养）、P311缺氧＋HIF-1α抑制剂组（HIF-1抑制剂处理后转染P311报告基因质粒然后进行缺氧培养），分别于培养0、12 h检测荧光素酶活性，采用生物信息学方法预测HIF-1α对P311转录调节的结合位点并查找P311启动子序列。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验以及Bonferroni校正。结果（1）ESC结果。细胞呈现铺路石样改变，细胞由于增殖潜能不同而呈现不同克隆状态。CD71－CD49f＋细胞占85%左右，说明ESC的干性较强、纯度较高。与P311基因敲除小鼠常氧组比较，单纯缺氧组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小（P值均小于0.05），缺氧组、野生型小鼠常氧组、DMSO对照组、HIF-1α抑制组、HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较小（P值均小于0.05）。与野生型小鼠常氧组比较，缺氧组、单纯缺氧组、DMSO对照组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小（P值均小于0.05），HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较小（P〈0.05）。与单纯缺氧组比较，缺氧组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较大（P值均小于0.05），HIF-1α抑制剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较大（P〈0.05），HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小（P值均小于0.05）。7组小鼠细胞间划痕后48 h划痕剩余宽度总体比较差异不明显（F＝19.02，P〉0.05）。野生型小鼠ESC缺氧0、12、24、48 h的HIF-1α蛋白表达量分别为1.02±0.05、2.56±0.09、1.60±0.17、1.17±0.03。与缺氧0 h比较，HIF-1α蛋白表达量缺氧12 h明显增加（P〈0.01），缺氧24 h开始下降但仍高于缺氧0 h（P〈0.05），缺氧48 h后降至常氧水平（P〉0.05）。与单纯缺氧组比较，HIF-1α抑制剂组细胞缺氧各时相点P311 mRNA表达量均明显下降（P值均小于0.05），HIF-1α稳定剂组细胞P311 mRNA表达量则在缺氧12、24 h明显升高（P值均小于0.05）。与HIF-1α抑制剂组比较，DMSO对照组和HIF-1α稳定剂组细胞在缺氧0、12、24 h P311 mRNA表达量均明显升高（P值均小于0.05）。与单纯缺氧组比较，HIF-1α抑制剂组细胞缺氧各时相点P311表达量均明显下降（P值均小于0.05），而HIF-1α稳定剂组细胞P311表达量则在缺氧12、24 h明显升高（P值均小于0.05）。与HIF-1α抑制剂组比较，DMSO对照组和HIF-1α稳定剂组细胞P311表达量在缺氧12、24 h明显升高（P值均小于0.05）。（2）HEK-293细胞结果。培养0 h，空载缺氧组、P311常氧组、P311缺氧组、P311缺氧＋

摘要：背景:关于缺氧性肺动脉高压发病过程中缺氧诱导因子1α和诱导型一氧化氮合酶在肺动脉壁内的动态变化尚需探讨。目的:观察不同缺氧时间点肺动脉壁内缺氧诱导因子1α和诱导型一氧化氮合酶基因表达,探讨其在缺氧性肺动脉高压发病机制中的作用。设计:对比观察的动物实验。单位:南华大学附属第二医院呼吸内科。材料:选用健康雄性Wistar大鼠40只,清洁级,6～8周龄,体质量(220±10)g。按随机表法分为对照组(n=8)和缺氧组(n=32),其中缺氧组又分为缺氧后3,7,14,21d4个时间点进行观察,每个时间点8只。方法:实验于2004-08/2005-12在南华大学肿瘤研究所完成。缺氧组大鼠按李启芳报道的方法进行干预。对照组大鼠置于同一室内,除不缺氧外,余同缺氧组。按照观察时间点将大鼠麻醉后,右颈外静脉插入微导管,连接多导生理记录仪,检测大鼠肺动脉平均压。将大鼠处死取出心脏称量右心室、左室加室间隔的质量,以右室肥大指数反映右心室肥厚程度。取大鼠右上肺组织,进行苏木精-伊红染色和弹性纤维染色。用病理图像分析软件测定肺动脉管壁面积/管总面积、管腔面积/管总面积、肺细小动脉中膜平滑肌细胞密度、肺细小动脉中膜厚度作为肺小血管重塑指标。对肺小血管壁缺氧诱导因子1α,诱导型一氧化氮合酶进行原位杂交和免疫组织化学检测,以肺细小动脉管壁平均吸光度值作为mRNA表达和蛋白水平的相对含量。主要观察指标:①大鼠肺动脉平均压、右心室肥厚程度和肺小血管重塑指标的变化。②缺氧诱导因子1和诱导型一氧化氮合酶的表达及其与肺动脉平均压,肺血管重塑的关系。结果:共纳入Wistar大鼠40只全部进入结果分析。①缺氧7d时肺动脉平均压明显高于对照组(P<0.05),14d达到最高水平,之后维持于此水平。②缺氧14d右心室肥大指数高于对照组(P<0.05)。③缺氧7d肺小动脉管壁增厚,管腔变窄,肺动脉管壁面积/管总面积、管腔面积/管总面积与对照组比较,差异明显(P<0.05);缺氧14d可见肺小动脉中膜和肺细小动脉中膜平滑肌细胞密度增高,肺细小动脉中膜厚度明显增加(P<0.05)。21d管腔进一步变窄,平滑肌增生明显。④缺氧诱导因子1和诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达:对照组大鼠呈弱阳性表达;缺氧3d和7d缺氧诱导因子1αmRNA相对量无明显变化,14d时明显增高,此后维持于高水平。诱导型一氧化氮合酶mRNA在缺氧3d明显高于对照组,7d达到高峰,14d接近对照组水平,21d再次升高,但低于缺氧3d时。⑤缺氧诱导因子1α主要表达于血管内膜和中膜,而诱导型一氧化氮合酶表达涉及血管全层。诱导型一氧化氮合酶在对照组肺血管内膜和中膜均弱阳性表达,缺氧3d与对照组差异不明显,7d中膜、内膜表达明显,14d血管中膜增厚,表达增强。在血管外膜,对照组诱导型一氧化氮合酶为阴性,各缺氧组均阳性表达。⑥mPAP与肺血管重塑正相关(r=0.976,P<0.01),缺氧诱导因子1αmRNA与诱导型一氧化氮合酶蛋白正相关(r=0.927,P<0.05)。结论:缺氧诱导因子1α和诱导型一氧化氮合酶均在大鼠缺氧性肺动脉高压的发病过程中发挥作用,且缺氧诱导因子1α与诱导型一氧化氮合酶基因表达可能存在相互调控。

摘要：自噬是细胞清除老化元件和受损蛋白的过程,与肿瘤的产生和进展有密切联系。上皮间质转化(EMT)是上皮表型的细胞经过一系列变化获得侵袭和迁移能力,产生间质特性的过程。自噬可能在低氧环境下清除缺氧诱导因子1(HIF-1)进而抑制EMT相关基因转录,抑制TGF-β/Smad信号通路从而抑制EMT,通过选择性自噬适配器p62对泛素化蛋白的作用调节EMT转录因子抑制EMT。对自噬与EMT关系的深入研究有助于找到肿瘤治疗的新靶点。

摘要：目的:构建重组人HIF-lα真核表达质粒,为进行人HIF-lα基因的克隆与表达做准备。方法:从人外周血细胞中提取总RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法反转录合成cDNA。分别以含有绿色荧光蛋白(EGFP)片段的质粒PIREGFP质粒和反转录合成的cDNA为模板,加入所设计的3对引物[EGFP-linker、HIF-1α)上游(up)和下游(down)引物]所扩增目的基因片段分别与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,LB/Amp平板培养基筛选菌落,提取质粒。测序正确后经酶切先后克隆进入pVAX1载体。结果:通过聚合酶链反应(PCR)分别获得约870、1199和672bp的特异性DNA片段,分别与T载体连接后测序,测序结果与GenBank所提供的基因序列相同。将以上3个片段依次连入pVAX1载体后,所得质粒经酶切鉴定后获得约1800bp片段,与预想结果一致。结论:成功构建了重组人HIF-1α真核表达质粒pVAX1-EGFP-linker-HIF-1α。

摘要：背景:慢病毒载体可稳定介导基因沉默且具有较高的转染效率。目的:构建并鉴定脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体。方法:针对脯氨酰羟化酶2基因序列设计RNA干扰靶序列,合成靶序列的寡聚DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切的pGCSIL-GFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,产生重组RNA干扰慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果与结论:PCR和DNA测序证实合成的含脯氨酰羟化酶短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pGCSIL-GFP载体。说明实验成功构建脯氨酰羟化酶基因RNA干扰慢病毒载体。

摘要：目的:探讨低氧对肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖和凋亡的影响,以及HIF-1α、P-ERK1/2、iN-OS蛋白表达变化在其中的作用与意义。方法:体外培养大鼠PASMC,设计常氧组、低氧组及ADM、L-NAME、PD98059干预组,用MTT比色法和PCNA的免疫组化法测定细胞增殖反应,用流式细胞仪检测细胞凋亡,用West-ern blotting法检测HIF-1α、P-ERK1/2、iNOS的蛋白表达。结果:(1)低氧24h组的A值明显高于常氧组(P0.05)。(4)Western blotting表明常氧组少量HIF-1α、iNOS、P-ERK1/2表达,低氧4h后均表达增高(P<0.01),8h仍维持在高峰(P<0.01),而HIF-1α、P-ERK1/2在低氧24h后表达下调。L-NAME促进了HIF-1α表达(P<0.01),PD98059部分抑制了HIF-1α、iNOS及P-ERK1/2表达(P<0.01);ADM部分抑制了HIF-1α表达,促进iNOS表达(P<0.01)。结论:低氧能促进肺动脉平滑肌细胞增殖,对细胞的凋亡无影响;HIF-1在低氧诱导肺动脉平滑肌细胞增殖中起重要作用。