摘要：目的 建立基于荧光重组酶聚合酶核酸扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)技术快速检测粪样中美洲钩虫卵的方法,并评价其效能,为快速检测粪样中美洲钩虫卵提供技术支撑。方法 根据美洲钩虫的cox1基因序列设计荧光RPA引物及探针并进行筛选,建立荧光RPA检测方法。将美洲钩虫卵基因组DNA稀释至100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、0.1 fg/μL等7个浓度梯度以测定荧光RPA法的最低检出值,利用荧光RPA法检测日本血吸虫、蛔虫、华支睾吸虫、肝片形吸虫DNA样本进行交叉反应实验。采集44例人粪样并进行DNA提取,运用改良加藤厚涂片法(Kato-Katz)、半巢式PCR法、荧光RPA法同时检测,评价荧光RPA法的灵敏度和特异度。结果 建立的荧光RPA法可在20 min内特异性扩增出美洲钩虫cox1基因长度为194 bp的片段,最低检出值为10 fg/μL,与日本血吸虫、蛔虫、华支睾吸虫、肝片形吸虫均无交叉反应。通过对44份人粪便样本进行检测,Kato-Katz法和半巢式PCR法均检出26例阳性样本,荧光RPA法检出27例阳性样本,其中1号样本荧光曲线在反应后期略高于阴性对照,但未出现与阳性对照相似反应趋势,因此判定为疑似阴性样本。荧光RPA法与Kato-Katz法和半巢式PCR法相比,其灵敏度均为100.00%,特异度均为94.44%,检测结果一致性较好(Kappa=0.953>0.75)。结论 荧光RPA法可在短时间内实现对美洲钩虫高效、敏感、特异的检测,有望应用于美洲钩虫感染的监测及预警。

摘要：目的分离美洲钩虫(Necator americanus)Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂1(Na Ku I1)c DNA,并进行原核表达,研究其抑制蛋白酶的效果。方法根据Gen Bank上预测的不完整的Na Ku I基因序列(XM_013449790)设计引物,运用快速扩增c DNA末端技术(SMART-RACE)分别从美洲钩虫成虫c DNA中扩增Na Ku I1 c DNA的5′和3′末端序列,拼接获得全长Na Ku I1 c DNA。将Na Ku I1成熟肽编码基因连接入原核表达载体,构建重组质粒p ET32a-sumo/Na Ku I1,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导Na Ku I1融合蛋白表达。表达产物包涵体经变性、复性、Ni-NTA亲和层析纯化后,用SUMO蛋白酶切割融合蛋白标签后获得重组蛋白r Na Ku I1。用凝血时间法检测r Na Ku I1的抗凝活性,发色底物法检测其对人纤溶酶、胰蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和蛋白酶3、猪胰蛋白酶和胰弹性蛋白酶及牛α-胰糜蛋白酶的抑制作用。结果获得Na Ku I1全长c DNA,其编码的多肽由84个氨基酸残基组成,其中含16个氨基酸残基组成的信号肽,68个氨基酸残基组成的成熟肽。成熟肽原核表达产物为不可溶的包涵体。经变性、复性后纯化的r Na Ku I1无抗凝血活性。在100倍摩尔浓度比下,r Na Ku I1对人纤溶酶(5 nmol/L)、人胰蛋白酶(1 nmol/L)和猪胰蛋白酶(5 nmol/L)活性的抑制率近100%,对牛α-胰糜蛋白酶(1 nmol/L)和人中性粒细胞弹性蛋白酶(5 nmol/L)活性的抑制率分别约31.45%和25.18%,对人组织蛋白酶G、蛋白酶3和猪胰弹性蛋白酶均无抑制作用。r Na Ku I1抑制人胰蛋白酶及纤溶酶的抑制常数(ki)分别为(21.17±7.22)和(21.72±3.95)nmol/L。结论成功分离获得Na Ku I1全长c DNA序列,其原核表达产物r Na Ku I1具有较强抑制胰蛋白酶和纤溶酶活性的特点。

摘要：目的原核表达美洲钩虫(Necator americanus)丝氨酸蛋白酶抑制剂NaKuI3,检测其对丝氨酸蛋白酶的抑制活性。方法根据美洲钩虫序列(GenBank ***_013451492)设计引物,以美洲钩虫成虫cDNA为模板,通过SMART-RACE方法相继分离NaKuI3的3'和5'cDNA末端序列;构建重组表达质粒pET32a-sumo/NaKuI3,将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并用Ni-NTA亲和纯化和SUMO酶酶切获得rNaKuI3,用发色底物法检测rNaKuI3对丝氨酸蛋白酶的抑制活性。结果成功从美洲钩虫中获得了新的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂-NaKuI3全长cDNA,推测其完整阅读框(ORF)为225bp,编码74个氨基酸残基组成的多肽,具有19个氨基酸残基组成的信号肽。rNaKuI3对猪胰蛋白酶、人纤溶酶、人中性粒细胞弹性蛋白酶和人蛋白酶3均有较强抑制作用,抑制常数(ki)分别为(16.40±2.08)nmol、(24.39±4.25)nmol、(38.39±3.92)nmol和(89.90±13.91)nmol,对人组织蛋白酶G也具有一定抑制活性,但对牛α-胰糜蛋白酶、猪胰弹性蛋白酶抑制作用较弱。结论融合蛋白美洲钩虫NaKuI3获得成功。该多肽对多种丝氨酸蛋白酶有抑制作用,是一种广谱的丝氨酸蛋白酶抑制剂,为进一步研究NaKuI3的生理学功能奠定了基础。

摘要：目的建立荧光定量PCR检测美洲钩虫的方法。方法提取虫体基因组DNA、根据GenBank中美洲钩虫ITS-2序列设计特异引物,PCR扩增ITS-2序列、克隆、测序和比对。常规PCR检验引物特异性。将ITS-2序列扩增产物回收、纯化后经T克隆转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为标准品模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做灵敏性和重复性试验。结果构建的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线的吸收峰单一,实验重复性良好。结论成功构建了SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测美洲钩虫的方法,可用于快速、准确、定量检测美洲钩虫。

摘要：目的建立一种快速、高效的环介导等温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测粪样中美洲钩虫虫卵。方法根据美洲钩虫ITS基因序列,设计4条LAMP引物,建立LAMP检测法。利用LAMP法检测日本血吸虫、肝吸虫、鞭虫、猪蛔虫、蛲虫的DNA样本以验证LAMP方法的特异度。以美洲钩虫成虫DNA样本,倍比稀释以评价LAMP法的DNA最低检出量。现场采集55份人粪DNA样本,采用改良加藤法、LAMP法和普通PCR方法同时检测,评价LAMP法的敏感性和特异性。结果LAMP法可特异性扩增美洲钩虫DNA样本。LAMP法可检测最低DNA浓度为1.2 fg/mL。通过现场样本对LAMP进行评价,LAMP法敏感性相对于改良加藤法和PCR法分别是95.24%和100%。特异性分别是97.06%和100%。结论建立起以虫卵为检测材料的检测美洲钩虫病的LAMP法,为美洲钩虫病提供特异、敏感、高效的检测方法。