摘要：雷公藤红素和雷公藤内酯甲是中药雷公藤的主要三萜活性成分,具有抗肿瘤、抗炎及免疫抑制等药理活性,是雷公藤相关中药制剂发挥临床疗效的物质基础。通过解析活性成分生源途径,优化基因元件并利用“细胞工厂”异源获取将是未来“低成本、高效率”获得雷公藤中三萜活性成分的有效途径。CYP712Ks是参与雷公藤木栓烷型和齐墩果烷型三萜骨架修饰的第一个细胞色素P450酶,发挥C-29位羧基化功能,可催化木栓酮生成美登木酸,催化β-香树素生成3-表卡通酸。本研究以四条多功能TwCYP712K1/2/3/5为研究对象,利用酿酒酵母体内功能表征,明确其催化功能及底物选择偏好性;通过同源建模和分子对接,明确蛋白与底物结合空间结构,进而对蛋白活性口袋内差异氨基酸进行互相突变,阐明决定催化功能和底物结构选择的关键氨基酸。本研究共构建了63个突变体元件,解析了影响TwCYP712Ks羧基化功能的氨基酸位点,特别是揭示了影响TwCYP712K2对齐墩果烷型和木栓烷型三萜底物选择性的关键氨基酸,TwCYP712K2F127I与TwCYP712K2A227T突变体将导致产物比例发生逆转。本研究以同源蛋白比对及相互突变的方式对TwCYP712Ks四条蛋白进行半理性设计,阐明多个决定蛋白催化功能的氨基酸位点,获得系列活性提升或改变的突变体,为雷公藤三萜活性成分的生物合成提供丰富的催化元件,并初步解析了C-29位羧基化机制。