摘要：为了建立一种快速、灵敏且特异的沙门氏杆菌快速筛选检测方法——聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR),试验针对沙门氏杆菌菌毛保守操纵子bcfD基因设计特异性扩增引物,通过优化反应温度、dNTPs浓度、Mg^2+浓度和反应时间以确定最佳反应体系;随后选取4株沙门氏杆菌标准菌株和12株近源菌进行特异性试验;通过菌落计数法和倍比稀释法确定PSR方法的最低检测灵敏度,并与常规PCR方法进行敏感度比较;用稀释后的沙门氏杆菌纯菌液人工随机污染40份不含沙门氏杆菌的生猪肉样品,模拟并评价PSR方法在现场检测中的应用效果。结果表明:试验成功建立并优化了PSR方法,最佳反应温度为65℃、dNTPs浓度为0.3 mol/L、Mg^2+浓度为3.0 mmol/L、最佳反应时间为45 min;PSR方法可以特异性扩增4株沙门氏杆菌,而对其他12株近源菌的扩增结果呈阴性;经菌落计数和倍比稀释后,PSR方法的最低检出量为4×10^1cfu/mL,为常规PCR方法的100倍;从40份经人工随机污染生猪肉样品中共检测出阳性样品7份,与传统培养法的检测结果一致,检出率均为17.5%。说明试验建立的PSR方法对沙门氏杆菌的检测特异性强、灵敏度高,且不需要昂贵的设备即可在短时间内实现对沙门氏杆菌属的快速检测。

摘要：目的建立利用聚合酶螺旋反应(PSR)快速检测甲型H1N1流感病毒的方法。方法针对甲型H1N1流感病毒的特异性HA基因设计了6套引物,通过实时浊度法和显色法两种方法判断结果。结果与结论从6套引物中筛选出了最佳引物,并确定最佳温度为65℃;进一步实验表明最佳引物能特异性地检测H1N1病毒,与14种其他呼吸道病原核酸无交叉反应,敏感性达到100拷贝,与PCR敏感性一致。所建立的方法简单快速、特异性强、敏感性高,适合现场和基层单位应用推广。

摘要：聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR)是基于环介导等温扩增技术(LAMP)和聚合酶链式反应(PCR)建立的一种新型恒温体外核酸扩增技术,其利用混合引物的设计思路和BstDNA聚合酶的链置换活性,实现了在体外等温条件下的核酸扩增,表现出灵敏性及特异性较PCR显著提高,引物设计较LAMP简单等优点,在保证检测灵敏、特异的同时,耗时相对较短,且操作简便,对仪器设备要求低,可肉眼直观判定结果,特别适用于公共卫生、动物健康、食品安全和生物防御等领域的快速诊断。本文介绍了PSR技术的原理及其在病原微生物检测方面的应用,以期为相关领域的检测技术研究提供参考。

摘要：【背景】铜绿假单胞菌是一种重要的水源和食源性致病菌,可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病。加强铜绿假单胞菌的快速检测,对保障食品安全具有重要的意义。【目的】建立聚合酶螺旋反应(Polymerasespiralreaction,PSR)方法快速检测铜绿假单胞菌。【方法】针对铜绿假单胞菌外毒素A调控基因——ETA基因(toxA)设计引物,通过引入加速引物、优化反应条件和筛选颜色指示剂,建立快速检测铜绿假单胞菌的PSR方法,并研究方法的特异性、敏感性和可靠性。【结果】建立的方法在等温65°C条件下,40 min内可完成PSR反应,且可通过钙黄绿素和羟基萘酚蓝直接判读结果。方法特异性强、灵敏度高,最低检出限分别为20 CFU/mL细菌和1.011 5 pg/μL基因组DNA。可视化PSR方法检测包装饮用水来源的分离菌株与传统生化方法检测结果一致。【结论】研究建立的可视化PSR方法为铜绿假单胞菌DNA快速检测提供了一种可行的有效手段。

摘要：为建立一种快速、简便检测猫细小病毒(FPV)的聚合酶螺旋反应(PSR)恒温扩增方法,本研究参考GenBank中登录的FPV基因序列(MG924893.1),以其保守基因NS1为靶基因设计并合成分别用于普通PCR和PSR方法的2对特异性引物,以及一对加速引物,经反应条件优化,建立了检测FPV的PSR方法。优化结果显示,体系内包含6 mmol/LMgSO_(4)、0.8 mol/L甜菜碱,67℃恒温反应45 min结束反应,然后加入终浓度为20×SYBRGreenI染料,肉眼在可见光下观察颜色变化即可判定检测结果。利用该方法检测猫冠状病毒(FCoV)、猫诺如病毒(FNoV)cDNA和FPV,结果显示除了FPV外,与其他病原均无交叉反应,特异性强;将提取的FPV基因组DNA 10倍倍比稀释,利用建立的PSR方法进行敏感性试验,结果显示,该方法对FPV基因组的最低检测限为6.75×10^(3)拷贝/μL,比普通PCR方法检测下限低10倍,敏感性可接受;利用本方法进行组内组间重复试验,结果显示组内与组间重复性试验检测结果一致,均为阳性,重复性好。利用建立的PSR方法对110份疑似感染FPV的猫粪便样品进行检测,结果显示PSR方法与常规PCR方法的检测结果基本一致,二者的总符合率为98.18%,表明本研究建立的PSR方法可用于检测临床样品。本研究首次建立的FPVPSR方法仅需2对引物在67℃下完成,无需复杂的变温仪器,反应后加入染料肉眼即可判定结果,整个过程在45 min内结束,设计引物简单,操作步骤少,用时较短,适合市县级宠物医院FPV感染的快速诊断。

摘要：目的建立聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR)检测结核分枝杆菌的方法并评价效果。方法针对结核分枝杆菌插入序列IS6110设计引物进行PSR检测。提取结核分枝杆菌基因组DNA,加入Bst DNA聚合酶的RM2X反应液中,在荧光定量PCR仪上于63℃反应45 min,通过荧光信号进行检测。通过对引物序列进行优化,筛选出最佳引物序列,并对其检测特异性和最低检出限进行评估。于2019年5—8月间从郑州市第六人民医院连续收集200例肺结核患者痰液样本(同一患者收集3份),对痰标本进行痰涂片、固体痰培养和PSR检测。以痰培养结果为参照,评价PSR对结核病患者的检测效能。结果通过引物序列优化,筛选出一套对结核分枝杆菌检测的PSR引物,使用该引物进行PSR的最低检出限可达到10~3菌落形成单位(CFU)/ml;检测特异性实验表明该方法与15株非结核分枝杆菌无交叉反应。200例肺结核患者中,痰涂片检测阳性48例,阳性检出率为24.0%(48/200);痰培养检测阳性83例,阳性检出率为41.5%(83/200);PSR方法检测阳性87例,阳性检出率为43.5%(87/200)。以痰培养结果为标准,PSR检测结核病的敏感度和特异度分别为96.4%(80/83)、94.0%(110/117),阳性预测值为92.0%(80/87),阴性预测值为97.3%(110/113),与痰培养检测方法基本一致(Kappa值为0.898)。结论PSR检测适用于结核分枝杆菌的快速筛查。

摘要：为建立一种快速、高效地检测猪源沙门氏菌的聚合酶螺旋反应(PSR)方法,本研究针对猪源沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因设计3套特异性扩增引物,通过优化孵育温度、dNTPs和Mg2+浓度、Bst聚合酶浓度和反应时间初步建立了猪源沙门氏菌PSR方法。结果显示:该方法可以特异性扩增2株猪沙门氏菌,而对其它12株病原菌无扩增,特异性较强;以沙门氏菌标准株CMCC 50094为模板,并经一系列的稀释,对PSR、LAMP和qRCR方法的敏感性进行检测和比较,结果显示PSR方法和qPCR方法对菌液的最小检出量均为5×101 cfu/mL,敏感性为LAMP方法的10倍,敏感性较高;临床样品检测结果显示,经PSR方法在132份仔猪腹泻样本中共检测出猪源沙门氏菌阳性样品18份,与常规培养方法鉴定结果一致,检出率均为13.64%。本研究建立的PSR法为猪源沙门氏菌的快速检测提供了一种可行方法。

摘要：目的:筛选聚合酶螺旋反应(Polymerase Spiral Reaction,PSR)检测呼吸道感染患者痰液中肺炎克雷伯菌的引物并进行初步应用。方法:基于肺炎克雷伯氏菌外膜蛋白基因设计PSR反应引物并进行筛选,对菌株特异性及最低检出限进行评估;于2019年9—12月从新疆医科大学第八附属医院连续收集270份疑似呼吸道感染患者的痰液样本,对痰标本进行细菌培养鉴定,PCR及实时荧光定量PCR检测。分别以痰培养及实时荧光定量PCR检测结果为参考,评价PSR检测痰液样本中肺炎克雷伯菌的检测效能。结果:实验结果表明该方法最低检出限可达到10^(2) CFU/mL,与其他18种常见致病菌无交叉反应。270例疑似呼吸道感染患者的临床样本痰培养法检出肺炎克雷伯菌阳性54例,PSR方法检测阳性68例。对比痰培养结果,PSR检测痰液样本中肺炎克雷伯菌的敏感度和特异度分别为96.30%(52/54),92.59%(200/216)。结合测序结果,其阳性预测值与阴性预测值分别为97.1%(68/70)及99.01%(200/202),与痰培养检测结果一致性较好(Kappa值为0.81)。此外,对比荧光定量PCR法结果,其敏感度、特异度分别为100%(62/62)和96.63%(201/208)。结论:PSR在痰液样本呈现了较高的检测性能,适合使用在临床上对肺炎克雷伯菌的快速检测。

摘要：目的:建立实时定量检测口腔内变形链球菌的实时定量聚合酶螺旋反应(PSR)方法。方法:针对变形链球菌的gtf B基因设计4套引物,通过实时浊度法和显色法两种方法判断结果。结果:从4套引物中筛选出最佳引物,并确定最佳温度为65℃;进一步实验表明采用最佳引物能特异性地检测变形链球菌,与13种其他病原核酸无交叉反应,敏感性达10拷贝/μL。结论:建立了实时定量检测变形链球菌的PSR方法,该方法具有简单快速、特异性强、敏感性高的特点,为实时定量检测变形链球菌提供了新技术。

摘要：目的用聚合酶螺旋反应(PSR)建立快速、灵敏、特异的鼠疫菌等温扩增方法。方法根据鼠疫菌F1基因设计引物,利用Bst DNA聚合酶链置换活性,通过添加pH指示剂和核酸荧光染料SYBR GreenⅠ,建立可视化PSR检测方法,并用于鼠脏器、血液、环境样本中鼠疫菌的检测。结果建立的PSR方法可在40 min内得到结果,最佳反应温度为64℃,最低检测限为100拷贝/μl,与14株非鼠疫菌无交叉反应。可成功检测模拟阳性样本。结论建立的PSR等温扩增反应为鼠疫菌的快速检测提供了新方法。