摘要：目的:建立聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法快速鉴别香加皮与其混淆品五加皮、地骨皮,避免因基原混乱影响用药安全。方法:从CGIR数据库获取的香加皮DSS标记序列,对香加皮DSS序列进行酶切位点分析,筛选香加皮与五加皮、地骨皮间差异位点,选择香加皮的特异性酶切位点Cla I,设计PCR-RFLP反应引物,对影响PCR-RFLP反应的退火温度、循环数、Taq酶、不同型号PCR仪、酶切时间等条件进行考察。利用建立的PCR-RFLP鉴别方法对不同产地香加皮与五加皮、地骨皮进行适用性考察。结果:在退火温度59℃、循环数为40个时,香加皮与五加皮、地骨皮样品经过特异性引物进行PCR扩增后,可出现清晰明亮的片段,酶切时间30 min,香加皮药材及其基原物种均可产生约140 bp和290 bp的目的片段,而2种混淆品五加皮和地骨皮药材及其基原物种只在250~500 bp有一条约430 bp的目的片段。该方法能对香加皮及其混淆品五加皮、地骨皮进行准确鉴别。结论:建立了香加皮与五加皮、地骨皮的PCR-RFLP鉴别方法,稳定性好、灵敏度高、适用性好,为香加皮与五加皮、地骨皮的质量控制提供参考。

摘要：目的:建立聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,用于湖北麦冬的分子鉴别。方法:在ITS 2区设计湖北麦冬、短葶山麦冬和麦冬的通用引物,经PCR反应后,对PCR产物进行限制性内切酶(Nae I)的酶切反应,酶切条件为37℃孵育60 min。结果:设计的通用引物对湖北麦冬和麦冬均能扩增出377 bp的单一条带,经酶切反应后,湖北麦冬被切为231 bp和146 bp 2条条带,麦冬仍为377 bp的单一条带,以此实现湖北麦冬的分子鉴别。结论:建立的PCR-RFLP方法能够实现湖北麦冬的准确鉴别,且该方法操作简单,特异性强,稳定性好,检测结果客观易判读。

摘要：目的建立PCR-RFLP方法检测疟原虫,并评价其应用效果。方法收集2010-2018年武汉市输入性疟疾患者血样。根据4种人疟原虫线粒体细胞色素b(Cytb)基因属、种特异位点,设计1组疟原虫属特异性公共引物。提取患者血样中的疟原虫DNA,巢式PCR扩增得到产物后,用限制性内切酶AluⅠ进行酶切,不同种疟原虫将产生特异性的酶切条带,建立PCR-RFLP检测方法。分析该方法的灵敏度和特异度,并与巢式PCR相比较,评价其应用价值。结果PCR-RFLP检测恶性疟、三日疟、间日疟和卵形疟血样(包括curtisi亚种和wallikeri亚种),最低检出阈值分别为2.5、2、3.6、4、1.5个虫/μL血。共检测121份疟疾血样和45份健康人血样,巢式PCR检出阳性115份,PCR-RFLP方法检出阳性118份,灵敏度分别为95.0%和97.5%,结果一致性较好(Kappa值=0.93),差异无统计学意义(χ2=0.8,P>0.05)。PCR-RFLP分别检测日本血吸虫、利氏曼原虫、隐孢子虫样品无任何扩增条带产生,均为阴性。结论建立的PCR-RFLP方法实验流程相对简单,且检出阈值低,敏感度、特异度高,检测结果易于判断,是一种新的疟原虫核酸检测方法。