摘要：制备弓形虫肌动蛋白(TgActin)多肽表位抗体并探讨其应用价值。BepiPred 1.0 Server在线分析设计TgActin抗原表位,并与多种属Actin进行同源比对,选取并合成高特异性多肽片段序列免疫新西兰兔。末次免疫后收集兔血清并使用Protein G纯化抗体,SDS-PAGE检测抗体纯度,ELISA测定抗体效价,Western blot分析抗体的特异性及TgActin表位抗体作为内参抗体的可能性,免疫荧光观察胞内速殖子形态。结果显示,ELISA测定抗体效价为1∶128000,Western blot结果显示抗体特异性识别弓形虫Actin,免疫荧光染色显示TgActin表位抗体可以标记纳虫泡内速殖子。结果表明,成功制备了TgActin多肽表位抗体,可用做弓形虫蛋白检测的内参抗体及其在细胞内的免疫荧光检测,为后续弓形虫研究提供了便利条件。

摘要：背景:肌动蛋白和Tau蛋白分别是微丝和微管的重要组成成分,肌动蛋白和Tau蛋白的分布能否作为微丝和微管的观察指标。目的:构建肌动蛋白和Tau蛋白的红色和绿色荧光蛋白融合表达载体并转染真核细胞,观察其在细胞内的表达和定位情况。设计、时间及地点:单一样本观察实验,于2008-03/08在南方医科大学病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室共同完成。材料:克隆在pcDNA3载体上的肌动蛋白和Tau蛋白真核表达载体pcDNA3-actin和pcDNA3-Tau,以及红色荧光蛋白表达载体pmCherry-C2和绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C2、大肠杆菌株DH5α和小鼠NIH3T3细胞系由南方医科大学病理生理学教研室保存。方法:将克隆在pcDNA3上的肌动蛋白和Tau蛋白亚克隆到红色荧光蛋白载体pmCherry-C2和绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上,然后转染NIH3T3细胞,利用荧光显微镜观察重组载体的表达和细胞内定位。主要观察指标:NIH3T3细胞转染24h后,利用Leica荧光显微镜观察上述重组载体在细胞中的表达和定位情况。结果:重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在NIH3T3细胞中可获得高量表达。融合蛋白发出的红色和绿色荧光均表明,肌动蛋白在细胞质中呈短丝状弥散分布,Tau蛋白以细胞核为中心呈放射状排列。结论:成功构建了肌动蛋白和Tau蛋白的不同荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞中得到有效表达,这为研究细胞骨架在信号分子移位中的作用提供了一个重要的工具。

摘要：目的对桑黄肌动蛋白(Actin)基因进行克隆及序列分析。方法搜索网上已知数据库中Actin基因,与本实验室测得的桑黄转录组数据进行生物信息学比对,找到转录组数据中与Actin相似性最高的片段,并根据其设计引物,提取桑黄菌丝体总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增Actin基因片段并对PCR产物进行测序。结果得到一段839 bp的序列,序列分析表明,该片段编码279个氨基酸,与其他物种Actin基因核苷酸序列同源性在87%以上。结论首次从桑黄中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。

摘要：目的克隆芍药Paeonia lactiflora肌动蛋白(Actin)基因组DNA序列并解析基因结构,分析Actin基因在芍药不同组织中的表达情况。方法根据本课题组报道的芍药Actin基因cDNA序列(JX310002)设计特异性引物,以芍药栽培品种"桃花飞雪"总DNA为模板,用KOD-Plus高保真DNA聚合酶扩增芍药Actin基因组基因,克隆PCR产物并进行测序。应用生物信息学软件预测芍药Actin基因的外显子及内含子,基于Blastn程序分析芍药Actin基因在核苷酸水平上的同源性,应用MEGA5.0软件构建分子系统进化树;设计跨越内含子的半定量RT-PCR扩增引物,分析芍药Actin基因在芍药根、茎、叶、花中的表达情况。结果测序结果表明芍药Actin基因组DNA序列全长1 405 bp,含4个外显子和3个内含子,3个内含子中共6个剪接位点均遵循高等真核生物5’端供位GU与3’端受位AG模式;共编码377个氨基酸,GenBank登录号为KF363830。设计了一对半定量RT-PCR扩增引物,其中上游引物跨越了芍药Actin基因的第1个内含子,可有效防止由DNA污染而造成RT-PCR扩增的假阳性;半定量RT-PCR分析结果表明Actin基因在芍药根、茎、叶、花等不同组织中的表达量保持恒定。结论首次克隆了芍药Actin基因组DNA序列并明确了其基因结构,半定量RT-PCR分析结果表明Actin基因可以作为芍药功能基因表达分析的内标基因。

摘要：为克隆扁果枸杞(Lycium barbarum Bianguo)肌动蛋白基因作为基因表达模式分析的内参基因,根据几种茄科植物肌动蛋白氨基酸序列保守区设计引物,以扁果枸杞3周龄叶总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增肌动蛋白基因片段并连接到p MD18-T载体上,阳性克隆经PCR检测后测序。结果表明,该基因片段长598 bp,编码198个氨基酸,与枸杞(Lycium chinense)核苷酸序列的相似度和同源性分别达97%和100%,说明是肌动蛋白基因片段,命名为Lb ACT。荧光定量PCR分析表明,盐处理下Lb ACT基因在各器官中的Ct值稳定,可作为内参基因用于研究扁果枸杞功能基因的表达模式分析。

摘要：目的克隆太子参肌动蛋白(Actin)基因片段并进行序列分析。方法利用植物Actin基因的保守序列设计简并引物,通过RT-PCR和抑制PCR扩增太子参Actin基因核心片段。利用半定量RT-PCR分析太子参Actin基因在不同种源、不同器官、不同生长发育时期的表达情况。结果通过RT-PCR获得3条太子参Actin基因的核心片段,长度均为760 bp,依次命名为PhACT1、PhACT2、PhACT3。通过抑制PCR及序列拼接后3条核心片段依次延长至1 008、1 008、975 bp,分别编码336、336、325个氨基酸残基。半定量RT-PCR分析表明PhACT2和PhACT3基因在不同种源、不同器官、不同生长发育时期的表达量基本恒定,PhACT1基因存在一定的差异。结论首次从太子参中克隆得到3条太子参Actin基因序列,并确定PhACT2基因适合作为太子参功能基因表达分析的内参基因。

摘要：目的克隆芍药肌动蛋白(Actin)基因并应用RT-PCR技术分析Actin基因在芍药不同组织中的表达情况。方法根据近缘物种Actin基因的保守序列设计一对PCR扩增引物,以"桃花飞雪"芍药根部总RNA反转录而成的cDNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出芍药Actin cDNA全长并克隆至pMD18-T载体上,阳性克隆经菌落PCR、质粒PCR及酶切鉴定后进行测序。基于测序结果设计特异性PCR引物,应用RT-PCR技术分析Actin基因在芍药根、茎、花、叶不同组织中的表达情况。结果测序结果表明芍药Actin基因全长1 134 bp序列,共编码377个氨基酸,GenBank登录号为JX310002;序列分析表明芍药Actin蛋白中存在3种肌动蛋白特征信号序列,与其他植物肌动蛋白氨基酸同源性达99%;基于同源模建预测的3D结构中含有4个结构域;生物信息学软件预测芍药肌动蛋白的相对分子质量为4.17×104,等电点(pI)为5.31,是一个定位于胞液、不含跨膜域、不含信号肽分子的亲水性、稳定蛋白;半定量RT-PCR技术分析表明Actin基因在芍药根、茎、叶、花组织中的表达量保持恒定。结论首次从芍药中克隆了Actin基因,半定量RT-PCR表达分析结果表明Actin基因适合作为芍药功能基因表达分析的内标基因,为有效利用该基因奠定了基础。

摘要：以几种豆科植物中肌动蛋白的氨基酸保守序列设计简并引物,采用RT-PCR结合RACE扩增技术,从柠条锦鸡儿叶片中克隆到一个编码肌动蛋白的基因,命名为CkACT。该基因cDNA全长为1655bp,开放阅读框1134bp,编码377个氨基酸。氨基酸比对分析表明,该基因编码的氨基酸与其他植物肌动蛋白基因具有较高的同源性。不同组织中的表达基本上一致,不同发育时期的基因表达相似,低温、NaCl、干旱和ABA处理后的表达强度没有明显差异,说明CkACT基因表达稳定。

摘要：目的克隆和表达刚地弓形虫肌动蛋白(TgACT)基因,并分析其免疫反应性。方法提取弓形虫RH株速殖子的总RNA。根据TgACT基因编码序列(登录号为XM_002369622.1)设计合成引物,进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,扩增产物经双酶切后连接入pET-30a(+)载体。将重组质粒pET30a-TgACT转化至大肠埃希菌(***)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。pET30a-TgACT在*** BL21(DE3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定。分别用抗多聚组氨酸标签(Anti-His)抗体和兔抗弓形虫血清为一抗进行蛋白质印迹(Western blotting)分析。结果 RT-PCR扩增产物约为1 100 bp。菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pET30a-TgACT构建成功。SDS-PAGE结果表明,目的蛋白在*** BL21(DE3)中以包涵体形式表达,相对分子质量(M r)约为49 000。通过蛋白的变性和复性处理及纯化,获得可溶性纯化蛋白。Western blotting结果显示,重组TgACT蛋白能被Anti-His抗体和兔抗弓形虫血清识别。结论成功构建重组质粒pET30a-TgACT,获得刚地弓形虫重组肌动蛋白,且具有免疫反应性。

摘要：以白桦(Betulaplatyphylla Suk.)次生木质部为材料,用改良CTAB方法提取总RNA。根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物后进行RT-PCR,并采用RACE技术扩增出Actin基因全长序列。该基因cDNA全长1785bp,序列分析表明,该基因编码区1134bp,编码377个氨基酸,5′非编码区157bp,3′非编码区495bp。所得序列与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性高达96%以上。此基因已在GenBank注册(EU588981)。根据高等植物肌动蛋白相似性构建了进化树,表明白桦肌动蛋白与蓖麻肌动蛋白之间的亲缘关系最为密切,在进化中分化时间最为接近。