摘要：目的克隆金黄色葡萄球菌野生株S407030肠毒素b(SEb)基因,并分析其分子特征。方法根据Genebank中金黄色葡萄球菌S6株肠毒素b基因设计1对引物,采用PCR法从金黄色葡萄球菌野生株S407030基因组中扩增目的基因,将目的片段与pMD-18T载体连接构建重组子pMD-18T-SEb,并转化*** DH5a;阳性克隆以双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法作序列测定分析,并以ExPasy Proteoic Tools蛋白分析软件预测其编码SEb蛋白的二级结构。结果从金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出约705bp的基因片段,所构建的阳性克隆重组子PCR及双酶切鉴定与预期结果一致;测序结果表明,克隆的SEb基因含705个碱基,与S6株序列相比无碱基的插入或缺失,同源性为98.4%;存在11个碱基变异,其中7个为无义突变,4个为有义突变(突变位点位于第364,699,899,988位,编码氨基酸变化分别为:Ser→Ala、Gln→His、Asn→Ser、Met→Leu);所预测的2菌株SEb蛋白的二级结构基本相同。结论本实验成功克隆了金葡菌野生株S407030SEb基因,其在不同菌株间相对保守;由SEb基因点突变引起的个别氨基酸的改变对SEb生物活性与毒力的影响有待进一步研究。

摘要：目的扩增金黄色葡萄球菌肠毒素b(SEb)基因,构建其原核表达载体,并进行诱导、表达,为其应用研究奠定基础。方法根据Genbank中SEb的基因序列,设计一对分别含bamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经bamHⅠ、XhoⅠ双酶切,并与做相应酶切的pET-28α(+)连接,转化大肠杆菌bL21,提取质粒进行双酶切鉴定及测序,用IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot印迹鉴定表达产物。结果成功扩增出SEb基因,基因大小为801bp,重组PET-28α(+)-SEb双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEb在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99%。经IPTG诱导后,pET-28α(+)-SEb/bL21在相应的相对分子质量(35×103)可见融合蛋白以包涵体形式表达,免疫印迹在相应分子量检测到目的蛋白。结论克隆了SEb基因,并成功在大肠杆菌bL21中以包涵体形式表达,为肠毒素b应用研究奠定了基础。