摘要：目的　得到肺炎支原体主要粘附蛋白 (P1蛋白 )的表达蛋白。材料与方法　用PCR产物限制性片段长度多肽性(RFLP)分析等方法鉴定实验用肺炎支原体菌株。针对P1蛋白基因设计上、下游引物 ,进行PCR扩增。对PCR产物进行回收、纯化 ,克隆入PET - 2 8C(+)表达载体 ,并转化入宿主菌BL2 1。对重组质粒进行酶切及PCR鉴定后 ,IPTG诱导目的蛋白在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达 ,并以Ni-Agarose亲和层析柱纯化。结果　 1)本实验所用菌株为肺炎支原体 2型。 2 )经PCR扩增得到预期含有BamHI和XhoI的 5 33bp的目的片段。 3)完成目的基因片段的克隆与表达 ,得到 2 0kDa左右表达蛋白。经诱导阳性质粒的蛋白表达 ,得到较大量纯化的目的蛋白。结论　本研究以国际标准株FH为模板 ,成功获得纯化的近 2 0kDa的P1蛋白片段 ,其大小与目的片段理论值相符 ,且此片段在肺炎支原体 1型与 2型中的基因同源性为 98%。为在基因和蛋白水平进一步研究肺炎支原体P1蛋白成分在肺炎支原体粘附和引起机体免疫反应中的作用机制 ,打下了良好的基础。

摘要：根据GenBank公布的肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)P1蛋白羧基端序列(AF290001.1),设计合成2对特异性引物,采取套式PCR方法,以肺炎支原体培养物中提取的DNA为模板,扩增肺炎支原体P1蛋白羧基端基因序列,将其克隆至pET32a表达载体,构建重组质粒pET32a/P1(3 802～4 695),转化大肠埃希菌BL21-gold,测序验证后IPTG诱导表达,经SDS-PAGE表明重组蛋白表观分子质量与预期一致,可溶性表达产物经Western blot证实重组蛋白具有免疫反应性。

摘要：目的探索一种适用于临床标本检测的肺炎支原体套式PCR．P1一RFLP基因分型方法并对其应用进行评价。方法参考肺炎支原体标准株P1基因RepMp4及RepMp2／3序列，分别在两个序列内部设计4条内套引物，采用文献报道的外套引物及新设计内套引物进行套式PCR扩增，扩增产物混合后用HaeⅢ酶切，根据不同的酶切图谱结果判断其型别，同时采用测序验证；对标准株DNA及临床标本DNA倍比稀释后进行检测，验证新改良方法敏感性；收集2012年肺炎支原体感染阳性标本，采用研究新改良的方法进行分型检测并与现有方法进行比较。结果经测序验证，以套式PCR为基础的P1-RFLP基因分型方法能够对临床标本进行很好的扩增；与现有的分型方法相比，新改良方法敏感性提高10^3倍，差异有统计学意义；北京地区2012年儿科肺炎支原体流行基因型为I型。结论套式PCR—P1-RFLP基因分型方法敏感性高，能够对临床标本进行很好的扩增。

摘要：【目的】针对肺炎支原体新型p1基因型(V2c型)菌株检测工作的需要,建立相应PCR检测方法并进行评价。【方法】针对新型V2c型肺炎支原体菌株p1基因变异区域序列设计特异性扩增引物,建立对V2c型肺炎支原体菌株进行PCR检测的检测方法并用相关基因测序进行验证。使用所建立的巢式多重PCR对北京地区2008-2011年分离到的214株临床肺炎支原体进行分型分析。【结果】特异引物可有效检测出V2c菌株,在其它型别菌株均无阳性扩增。214株肺炎支原体临床分离株中1型菌株占90.2%(193/214),V2a型菌株占0.9%(2/214),V2c型菌株占8.9%(19/214);未检出2型菌株。【结论】针对V2c型肺炎支原体所建立的基于p1基因的PCR检测方法,能有效区分以往方法无法检测出的新型V2c型肺炎支原体菌株,对开展肺炎支原体流行病学调查和病原分析有重要意义。

摘要：目的建立一种基于临床标本核酸的肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)核酸检测及基因分型方法。方法通过基因组学比对,选取Mp Genotype 1型和Genotype 2型菌株特异性靶序列设计合成引物和探针,建立Mp双荧光探针PCR检测分型方法,同时评价该方法的特异度、准确度、检测限和重复性。采用建立的荧光PCR方法对临床标本核酸进行检测,并与已报道的荧光PCR方法进行比对。结果对与Mp种属关系相近的其他种支原体以及常见呼吸道细菌、病毒等18种病原体的核酸进行检测,结果显示均无交叉反应;对90份Mp核酸的检测及分型的准确度为100%。该方法对于Genotype 1型和Genotype 2型Mp检测限均为1.0拷贝/μl的核酸样本,组内、组间重复性实验变异系数均小于2.5%。对88份临床标本核酸的检测中,与已报道的荧光PCR方法RepMp1体系的检测结果相比,Kappa值为0.675,P值为0.267,显示出高度的一致性。结论本研究所建立的Mp核酸检测及基因分型方法敏感度和特异度高,分型准确,可应用于各级省市疾控系统对Mp的监测与防控,促进Mp防控体系的完善,增强监测能力,对Mp的预警预测具有重要意义。

摘要：目的表达肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)渗透压诱导蛋白C(OsmC)并测定其活性。方法在Mp中找出编码OsmC蛋白的基因,根据Mp OsmC基因序列设计特定引物,PCR扩增OsmC基因。利用EcoRI和XhoI对其进行双酶切,然后连接到表达载体pET28a,构建重组质粒pET28a-MpOsmC,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,采用镍柱亲和层析对重组OsmC蛋白进行纯化,利用氧化铁二甲酚橙试剂(FOX)测定OsmC蛋白的活性。结果肺炎支原体Mpn625基因编码OsmC蛋白。PCR扩增OsmC基因片段大小为426bp,连接到原核表达载体pET28a得到重组质粒pET28a-MpOsmC。重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达分子质量单位为19.4ku的重组Mp OsmC蛋白,与理论值相符。通过亲和层析,得到高纯度的目的蛋白。FOX试剂法测定Mp OsmC具有分解H_2O_2活性。结论重组Mp OsmC蛋白具有氧化酶活性,为探讨肺炎支原体的抗氧化机制提供了理论依据。

摘要：本文从机理分析的角度讨论了阿齐霉素治疗肺炎支原体的合理用药问题,利用室分析的方法给出阿齐霉素药代动力学一室模型,确定了在多次重复静脉注射用药情况下人体血药浓度累积模型。利用阿齐霉素药品说明书进行了数值计算,依计算结果对现有两种用药方案进行了比较,并给出新的用药方案。最后,绘制出三种用药方案的血药浓度图。

摘要：目的试验设计(design of experiment,DOE)法优化肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)培养基,以期提高MP产量。方法以MP(FH株)为试验菌株,PPLO培养基为基础,菌体蛋白含量为响应值,采用Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验及Box-Behnken试验对脑心浸液、水解乳蛋白、胨3号、精氨酸、小牛胸腺DNA、葡萄糖和胰蛋白胨7种培养基添加成分进行筛选及优化。以菌体蛋白含量及颜色变化单位(color change unit,CCU)为指标,验证改良培养基培养MP的效果。结果培养基各添加成分对MP生长影响作用大小依次为葡萄糖、胰蛋白胨、脑心浸液、精氨酸、月胨3号、水解乳蛋白、小牛胸腺DNA,最终筛选出脑心浸液、葡萄糖及胰蛋白胨3种添加物,最适浓度分别为5. 68、1. 34及2. 64 g/L。采用改良培养基培养MP 96 h时,菌体蛋白含量及CCU达最大,分别为851. 29μg/mL及10~9 ccu/mL。结论 DOE法实现了对MP培养基的优化,获得了影响MP生长的主要参数,提高了MP菌体产量。

摘要：根据 Gen Bank登录的猪肺炎支原体 2 32株 P97基因和 J株黏附因子基因设计了 1对引物 ,以我国猪肺炎支原体Z株 (强毒株 )基因组 DNA为模板 ,通过 PCR方法扩增了该株黏附因子基因的部分序列。经序列分析后 ,重新设计了1对带有 Eco R 和 Hind 酶切位点的引物 ,并经引物的定点突变 ,PCR扩增了 Z株黏附因子的 R1 R2 区。扩增产物经双酶切后克隆到表达载体 p ET- 32 (a) +中。该重组质粒经酶切鉴定后 ,将其具有正确阅读框架的重组质粒转化到大肠杆菌 BL2 1 (DE3)感受态细胞 ,37℃下经 IPTG诱导表达 ,得到相对分子质量约 2 90 0 0的融合蛋白 ,表达量约为 11%。

摘要：目的采用自行设计的引物,利用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立一种快速检测急性呼吸道感染患儿咽拭子标本中肺炎支原体的方法。方法针对肺炎支原体基因组内存在的重复序列SDC1设计6条特异性LAMP引物(SMP),使用实时浊度仪进行扩增反应并记录结果。对该方法进行灵敏度和特异性检测,并与文献报道的引物(JMP)进行比较。应用该方法和实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测55例儿童咽拭子标本并对结果进行比较。结果本研究中设计的肺炎支原体特异性SMP引物灵敏度高,最低检出肺炎支原体标准株FH的DNA拷贝数为6个。采用SMP引物的LAMP方法特异性好,与其他支原体和细菌间无交叉反应。55例临床标本分别使用SMP引物和JMP引物进行LAMP检测,两种方法的总符合率为98.2%;使用SMP引物的LAMP方法与Q-PCR的总符合率为96.4%。结论采用本研究设计的SMP引物所建立的LAMP方法灵敏度更高,特异性好,较Q-PCR操作简便,耗时短,可用于临床儿童咽拭子标本中肺炎支原体的实验室快速检测,具有良好的临床应用前景。