摘要：目的探讨硫化氢(hydrogen sulfide,H 2S)改善单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)小鼠肾脏纤维化的作用机制。方法采用C57BL/6小鼠单侧输尿管结扎建立肾脏纤维化小鼠模型。随机分为假手术(Sham)组、UUO组和UUO+硫氢化钠(NaHS)组。ELISA法检测血清H 2S浓度;HE染色和Masson染色观察肾脏病理改变;免疫组织化学和Western blot检测Klotho和DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)表达;RT-PCR检测双加氧酶(ten-eleven translocation,TET)表达;比色法检测TET活性;焦磷酸测序检测肾组织Klotho甲基化水平;羟甲基化DNA免疫共沉淀联合实时定量PCR法检测肾组织Klotho羟甲基化水平。结果与Sham组相比,UUO组血清H 2S浓度显著降低[(5.18±0.34)μmol/L vs.(4.23±0.21)μmol/L, P <0.05]。NaHS显著减轻UUO模型小鼠的肾小管间质纤维化( P <0.01),下调α平滑肌肌动蛋白( P <0.05)和纤连蛋白( P <0.05)表达,同时上调UUO小鼠肾组织Klotho表达( P <0.05),下调DNMT1表达( P <0.01),升高TET活性[(0.03±0.01) ng·min^-1·mg^-1 vs.(0.43±0.08) ng·min^-1·mg^-1 , P <0.05],降低 Klotho 基因启动子甲基化水平(11.83%±0.53% vs .7.39%±0.70%, P <0.01),升高 Klotho 基因启动子羟甲基化水平( P <0.05)。结论H 2S可通过增强TET活性,诱导 Klotho 基因启动子去甲基化,上调 Klotho 基因表达,从而减轻UUO小鼠肾脏纤维化。

摘要：肾脏纤维化是慢性肾脏病的特征性病理改变,临床缺乏有效治疗措施。肾脏特异抗衰老蛋白Klotho具有显著的抗肾脏纤维化作用,但在肾脏纤维化发生发展中受异常表观遗传修饰影响而持续下调,是防治肾脏纤维化的关键潜在靶点。笔者针对靶向干预Klotho缺失抗肾脏纤维化进行了一系列研究,首先确定了转化生长因子β(TGFβ)是导致肾脏纤维化Klotho下调的主要致病因子:TGF-β通过抑制miR-152和miR-30诱导DNA甲基化酶1/3a异常高表达,继而导致Klotho启动子超甲基化和Klotho沉默。接着发现中草药成分大黄酸和去乙酰化酶3(HDAC3)抑制剂能够分别通过抑制异常表达的DNA甲基化酶1/3a,缓解Klotho启动子超甲基化,及促进PPARγ240/265赖氨酸位点乙酰化修饰强化对Klotho的正向调控作用,进而恢复Klotho蛋白水平,并有效缓解肾脏纤维化及相关的慢性肾脏病和骨质病理损害。最终研究揭示了肾脏纤维化Klotho下调的表观遗传特征和有效干预策略,为重振Klotho治疗肾脏纤维化及相关疾病提供了新的设计思路。

摘要：目的针对I型胶原α1(I)链设计、构建人鼠同源的Ⅰ型胶原siRNA(COL1A1-siRNA)及其表达载体,并证实其有效性。方法利用软件设计人鼠完全同源的一对Ⅰ型胶原siRNA序列,并构建其表达载体。直接将I型胶原siRNA和构建的质粒转染至大鼠系膜细胞,利用RT-PCR方法观察对系膜细胞I型胶原蛋白表达的抑制作用。结果Ⅰ型胶原siRNA转染至大鼠系膜细胞后,与空白对照组及MOCK组比较,能够抑制Ⅰ型胶原的表达。其质粒对Ⅰ型胶原表达的抑制作用更加显著,呈剂量依赖性。结论所设计的Ⅰ型胶原siRNA为人与大鼠完全同源的siRNA序列,所有碱基完全匹配。可以成功转染到大鼠系膜细胞,并有效抑制I型胶原在细胞内的表达。质粒载体的方法同样能够抑制Ⅰ型胶原的形成,而且表达更稳定,作用更显著。

摘要：目的观察Smad2反义寡核苷酸(ODN)对高糖培养的系膜细胞分泌纤连蛋白(FN)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)的影响,探讨Smad2在肾小球硬化中的作用,寻找延缓肾小球硬化的新方法。方法设计、合成Smad2起始密码子部位的正义、反义和随机ODN,用脂质体法将ODN瞬时转染大鼠系膜细胞,并进行高糖培养。观察Smad2mRNA及蛋白的表达及其对系膜细胞细胞外基质(ECM)分泌的影响。结果转染Smad2反ODN义的大鼠系膜细胞,其Smad2mRNA及蛋白表达均降低,与高糖组、正义组和随机组相比差异有统计学意义(P0.05)。高糖组、反义组、正义组和随机组培养上清液中FN含量(ng/ml)分别为84.19±6.81、57.65±5.05、78.72±9.13、77.13±7.36;ColⅣ含量(ng/ml)分别为55.27±4.75、22.31±3.24、46.23±2.02、45.92±1.21。反义ODN组FN、ColⅣ的含量均减少,与高糖、正义、随机ODN组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论反义Smad2ODN可抑制高糖刺激引起的系膜细胞Smad2FN和Col的表达上调,该研究结果为延缓肾脏纤维化提供了新的思路和治疗途径。