摘要：目的:预测人肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)基因上的泛素化位点,并构建泛素化位点突变质粒,探讨突变质粒对人结直肠癌HCT116和SW480细胞中核因子κB(NF-κB)和激活蛋白1(AP-1)相对荧光素酶活性的影响。方法:采用UbPred、UbiSite和BDM-PUB软件预测TRAF6基因的泛素化位点,采用CE Design V1.04软件设计突变引物,采用突变试剂盒进行定点突变,采用PCR法扩增获得突变后的目的片段,扩增产物经Dpnl酶消化,去除甲基化模板质粒,消化产物在ExnaseⅡ催化作用下发生同源重组获得重组质粒;将重组质粒转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒进行DNA测序。采用双荧光素酶报告基因系统检测转染突变质粒后HCT116和SW480细胞中NF-κB和AP-1相对荧光素酶活性。结果:经过DNA测序,泛素化突变位点已经成功突变,泛素化突变质粒构建成功。与TRAF6野生型基因比较,转染第124、319和331位突变质粒后,结直肠癌HCT116和SW480细胞中NF-κB和AP-1相对荧光素酶活性降低(P<0.05或P<0.01),其中转染第124位突变质粒后,结直肠癌HCT116和SW480细胞中NF-κB和AP-1相对荧光素酶活性降低最明显(P<0.01)。结论:成功构建人TRAF6基因的泛素化突变质粒,TRAF6的第124位氨基酸是其最重要的泛素化位点,可能影响下游信号通路中NF-κB和AP-1的活性。

摘要：目的探讨肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)基因多态性与中风不同证型遗传易感性以及炎性反应相关数量性状的关联。方法本研究采用病例-对照设计,纳入中风风痰瘀阻证者311例、气虚血瘀证者284例、性别年龄相匹配的对照组605例。采用实时荧光定量PCR(RTPCR)方法检测了TRAF6 mRNA表达水平,运用Sequenom Mass ARRAY i PLEX平台对TRAF6基因rs5030411、rs5030416两个多态性位点进行基因分型,采用酶联免疫吸附实验法(ELISA)测定炎性细胞因子血清水平。用PLINK、SPSS软件进行统计学分析。结果中风风痰瘀阻证、气虚血瘀证患者的TRAF6 mRNA表达水平均显著高于对照组(P0.050)。携带rs5030411 CT基因型的风痰瘀阻证患者的白细胞介素-1b(interleukin-1b,IL-1b)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)血清水平显著高于其他基因型携带者。风痰瘀阻证患者的IL-1b、IL-6血清水平显著高于对照组(P<0.050)。结论 TRAF6基因rs5030416多态性可能影响中风风痰瘀阻证的发生,而rs5030411多态性可能参与调节风痰瘀阻证的炎性反应过程。

摘要：目的:构建并筛选肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)短发夹RNA(shRNA)表达质粒.方法:针对小鼠TRAF6 mRNA设计4条理论上最佳的siRNA序列,经退火成互补双链,将相应双链DNA插入pGCsi-U6/GFP/Hygro质粒中,构建重组表达质粒pGCsi-TRAF6-shRNA1,2,3,4,并以不同比例DNA质粒/脂质体转染重组质粒(1∶2、2∶5、1∶3和1∶4)至RAW264.7细胞中,观察转染效果.结果:靶向TRAF6 mRNA的4个shRNA重组质粒载体pGCsi-TRAF6 shRNA1,2,3,4,经测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,证实载体构建成功.应用荧光显微镜分析转染效率显示,DNA(g)/脂质体转染重组质粒(L)按1∶2、2∶5、1∶3和1∶4比例转染细胞的效率分别为13.7%±1.2%、24.5%±2.1%、19.3%±1.7%、16.3%±2.8%,以2∶5为最佳比例.只加了脂质体未加质粒(试剂对照)的细胞无荧光表达.结论:TRAF6靶向RNA干扰重组表达质粒构建成功,为进一步研究阻断TRAF6表达对急性肝衰竭过度炎症反应的基因治疗奠定基础.

摘要：目的:构建大鼠野生型肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)基因及其特异性短发卡状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察其在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达和沉默TRAF6基因的情况。方法:用DNA重组技术将针对大鼠TRAF6基因的CDS区序列(加HA标签)和针对其不同位点所设计的3种shRNA序列分别克隆到pcDNA3.1及pGenesil-1/GFP真核表达质粒中。在酶切鉴定及序列测定正确后,用NeonTM电转仪,将上述质粒分别转染入培养的大鼠GMC中,然后用Western blot检查HA-TRAF6融合蛋白的表达情况,同时筛选最有效的TRAF6shRNA。结果:限制性酶切及核酸序列分析确证,上述TRAF6基因过表达和shRNA表达质粒均构建成功。Western blot显示,构建的pcDNA3.1-HA-TRAF6质粒能在大鼠GMC中表达,且TRAF6 shRNA-1具有最佳的沉默效率。结论:本实验成功构建了大鼠野生型TRAF6真核表达质粒及其特异性的shRNA表达载体,这为今后进一步研究TRAF6基因的生物学功能提供了实验基础。

摘要：目的探讨RNA干扰技术沉默脂多糖诱导人肾小管上皮细胞HK-2中肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)基因表达后,对HK-2细胞表型转化及炎症因子表达的影响。方法应用阳离子脂质体法将设计合成的TRAF6小干扰RNA(siRNA)瞬时转染HK-2细胞。将HK-2细胞分为空白对照组、脂多糖组、阴性对照组和TRAF6 RNA干扰组。各组培养6、12、24 h后,倒置显微镜观察细胞形态,噻唑蓝法检测细胞增殖,酶联免疫吸附测定法检测细胞中白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量,实时荧光定量PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TRAF6 mRNA的含量,蛋白免疫印迹法检测TRAF6、α-SMA、p38、c-Jun氨基端激酶—丝裂原活化蛋白激酶(JNK MAPK)和核因子-κB抑制蛋白(NF-κB)的表达。结果 TRAF6 siRNA能显著降低脂多糖诱导HK-2细胞中TRAF6、α-SMA mRNA含量和蛋白的表达,TRAF6 siRNA转染后HK-2细胞的增殖能力减弱,细胞因子IL-6、TNF-α含量下降,p38、JNK MAPK和NF-κB蛋白的磷酸化水平均明显降低,均P<0.05。结论 TRAF6可通过MAPK-NF-κB信号通路介导脂多糖诱导的肾小管上皮细胞炎症反应和细胞表型转化。