摘要：背景:众多的研究已证实胰岛素样生长因子1在成骨细胞的增殖、分化、基质合成中发挥重要的调控作用,并参与调节骨改建及修复的一系列过程。目的:观察人胰岛素样生长因子1基因修饰的骨髓基质干细胞对骨损伤修复的促进作用及能否构建出具有良好生物学活性的组织工程人工骨,提高骨缺损修复质量。设计、时间及地点:对比观察,实验于2004-03/2005-05在苏州大学实验动物中心完成。材料:体外将胰岛素样生长因子1基因通过反转录病毒转入骨组织工程种子细胞骨髓基质干细胞,并与具有良好生物学活性的脱钙骨基质材料复合。方法:BalB/C裸鼠15只制备颅骨8mm缺损模型,随机数字表法分为3组,每组5只。胰岛素样生长因子1转染细胞组和空载体细胞组将两种不同植入物脱钙骨基质/胰岛素样生长因子1转染细胞和脱钙骨基质/空载体细胞分别植入颅骨缺损部位,空白对照组仅造模,不进行任何干预。造模后4周处死动物,取出颅骨进行组织学观察。主要观察指标:①反转录-聚合酶链反应检测转染细胞胰岛素样生长因子1mRNA的表达。同时收集转染后细胞上清,用蛋白免疫印迹检测重组胰岛素样生长因子1的表达。②扫描电镜观察细胞/基质材料复合物共培养3,6d后的生长情况。③颅骨缺损模型大体观察。④苏木精-伊红染色观察造模后4周各组颅骨缺损的修复情况。结果:①经反转录-聚合酶链反应及蛋白免疫印迹检测,胰岛素样生长因子1基因修饰的骨髓基质干细胞中有胰岛素样生长因子1mRNA及蛋白的表达。②扫描电镜观察转染细胞与脱钙骨基质共培养3d时胰岛素样生长因子1转染细胞组脱钙骨基质材料表面已有大量细胞黏附并向深部空隙长入;6d时脱钙骨基质表面黏附的细胞处已分泌出大量胶原纤维;而空载体细胞组各时间点黏附细胞数和胶原纤维产生量则均较少。③造模后4周各组植入物周围均无明显炎症反应,胰岛素样生长因子1转染细胞组植入物与颅骨缺损结合紧密;而空载体细胞组植入物可推动;空白对照组骨缺损处无新骨形成。④苏木精-伊红染色可见胰岛素样生长因子1转染细胞组植入物与颅骨缺损结合紧密,骨折缺损区有新骨及血管形成;空载体细胞组骨缺损区新骨形成较少;空白对照组缺损未见修复。结论:胰岛素样生长因子1转染的骨髓基质干细胞/脱钙骨基质复合物具有较好的骨缺损修复功能。

摘要：背景:胰岛素样生长因子1是近年来发现的一种神经营养因子。目的:验证胰岛素样生长因子1对局灶性脑缺血糖尿病大鼠的神经功能、神经细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-10/2008-03在齐齐哈尔医学院实验中心完成。材料:Wistar大鼠40只,体质量200～250g,雌雄不限,鼠龄2.0～3.0月。方法:线栓法制作糖尿病大鼠大脑中动脉栓塞模型,随机分成胰岛素样生长因子1组和对照组,每组12只。胰岛素样生长因子1组连续皮下注射胰岛素样生长因子1,10μg/(kg?d),对照组注射等量的生理盐水,两组分别注射7,14d,每时间点取6只。主要观察指标:对两组大鼠进行神经功能缺损评分,采用TUNEL染色计数脑缺血周边区神经细胞凋亡数,免疫组织化学方法观察Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果:胰岛素样生长因子1组神经功能缺损评分明显低于对照组(P<0.01);胰岛素样生长因子1组缺血周边区的TUNEL阳性细胞数均明显少于对照组(P<0.01);Bcl-2蛋白免疫阳性细胞明显多于对照组(P<0.01),Bax蛋白免疫阳性细胞明显少于手术对照组(P<0.01)。结论:胰岛素样生长因子1可增加糖尿病脑缺血之后缺血周边区Bcl-2蛋白的表达,减少Bax蛋白的表达,拮抗神经细胞凋亡,改善神经功能。

摘要：背景:生长因子可调整椎间盘细胞的增殖、分化及基质代谢,用于椎间盘退变的生物学治疗,既往的研究偏重于成骨性生长因子对髓核细胞的作用,对纤维环细胞的研究相对较少。目的:观察体外培养条件下胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子、转化生长因子β1对人退变纤维环细胞生物学活性的影响。设计、时间及地点:对照观察实验,于2007-11/2008-12在解放军南京军区福州总医院完成。材料:腰椎间盘手术患者的纤维环组织。方法:结合酶消化法和组织块培养法,体外单层培养人退变纤维环原代细胞。传代后通过免疫组织化学染色鉴定细胞。对传3代细胞分别采用不同生长因子干预,分为100μg/胰岛素样生长因子1组、10μg/L血小板源性生长因子组、10μg/转化生长因子β1组、100μg/L胰岛素样生长因子1+10μg/L血小板源性生长因子组、100μg/L胰岛素样生长因子1+10μg/L转化生长因子β1组、10μg/L血小板源性生长因子+10μg/L转化生长因子β1组、100μg/L胰岛素样生长因子1+10μg/L血小板源性生长因子+10μg/L转化生长因子β1组,以不加生长因子为对照组。主要观察指标:免疫组织化学染色观察传3代细胞。干预3,6d后,采用MTT法测定传3代细胞增殖,ELISA法测定细胞培养上清液中Ⅰ、Ⅰ型胶原和聚集蛋白聚糖质量浓度。结果:传3代细胞Ⅰ、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性。胰岛素样生长因子1促进人退变纤维环细胞增殖,轻度抑制细胞合成Ⅰ型胶原,促进合成Ⅰ型胶原和聚集蛋白聚糖,促Ⅰ型胶原合成作用轻度强于转化生长因子β1。血小板源性生长因子促进细胞增殖,作用强于胰岛素样生长因子1,其抑制细胞合成Ⅰ型胶原,轻度促进合成Ⅰ型胶原,无促合成聚集蛋白聚糖作用。转化生长因子β1抑制细胞增殖,促进合成Ⅰ、Ⅰ型胶原及聚集蛋白聚糖,促聚集蛋白聚糖合成作用强于胰岛素样生长因子1。多种因子联合作用较单种未见明显优势,未能呈现协同效应。结论:胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子、转化生长因子β1明显改变人退变纤维环细胞的生物学活性,可应用于对人类椎间盘退变的生物学治疗。

摘要：背景：基因工程是目前软骨修复的主要方法，脂肪间质干细胞以其来源丰富、取材容易、免疫相容性良好、体外培养可以较长时间保持分化表型、有较强的向软骨细胞转化的能力而成为理想的种子细胞。目的：探讨胰岛素样生长因子1基因转染对兔脂肪间质干细胞增殖的影响。设计、时间及地点：细胞学基因转染体外观察，于2006-03／2007-03在中国医科大学细胞生物实验室完成。材料：成年新西兰大白兔3只，由中国医科大学实验动物中，心提供。含有全长人胰岛素样生长因子1cDNA片段的质粒***-1由吉林大学徐莘香教授惠赠。方法：取兔颈后皮下脂肪，Ⅰ型胶原酶消化法体外分离培养兔脂肪间质干细胞。取传至第2代细胞，以．0．515;10^6/孔密度接种于6孔板，细胞融合至90％-95％时随机分为未转染组、转染空载体pcONA3．1组、转染质粒pcDNA3．1-hlGF-1组，采用脂质体介导基因转染法进行质粒pcDNA3．1-IGF-1转染，经G418筛选后培养4周。主要观察指标：采用RT-PCR及Westernblot方法检测胰岛素样生长因子1的表达情况，MTT法及流式细胞仪检测细胞增殖情况。结果：转染pcDNA3．1-hlGF-1组的脂肪间质干细胞内有大量胰岛素样生长因子1mRNA及蛋白表达，未转染组及转染空载体pcDNA3．1组无表达。细胞增殖曲线显示，转染质粒pcDNA31-hlGF-1组的脂肪间质干细胞增殖速度较其他2组细胞明显加快。流式细胞仪检测显示，转染质粒pcDNA3．1-hlGF．1组的脂肪间质干细胞较其他2组细胞的S期比例显著增加（户〈0．05），G1期比例显著下降（P〈0．05）。结论：质粒pcDNA3．1-IGF-1转染兔脂肪间质干细胞后，可以获得稳定表达，并能明显促进脂肪间质干细胞的增殖。

摘要：背景:临床观察及基础研究发现,合并颅脑损伤可加速骨折愈合,但具体机制尚不明确。目的:观察脑损伤后SD大鼠股骨骨折愈合过程中骨痂骨形态发生蛋白2和胰岛素样生长因子1的表达,探讨脑损伤对大鼠股骨骨折愈合的影响及其作用机制。设计、时间及地点:随机对照,基因水平动物实验,于2007-05/2008-03在华北煤炭医学院骨科实验室完成。材料:SPF级10周龄雄性SD大鼠48只。方法:48只SD大鼠随机分成2组,每组24只。参考文献建立大鼠单纯股骨骨折模型和脑损伤合并股骨骨折模型。于术后7,14,28d分批处死动物,行X射线摄片后,取股骨骨痂,分别用于提取总RNA进行实时荧光定量聚合酶链反应。主要观察指标:以X射线摄片观察骨折愈合情况;以苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色观察骨痂组织骨形态发生蛋白2和胰岛素样生长因子1的表达。结果:X射线摄片示,与单纯骨折组相比,骨折合并脑损伤组骨痂出现早,同一时间骨痂更大。免疫组织化学显示,造模7,14d脑损伤合并股骨骨折组骨形态发生蛋白2、胰岛素样生长因子1的平均阳性细胞百分率高于单纯骨折组。实时荧光定量聚合酶链反应结果发现,脑损伤合并股骨骨折组7,14d骨形态发生蛋白2基因mRNA表达高于单纯骨折组,7,14,21d胰岛素样生长因子1基因mRNA表达高于单纯骨折组。结论:与单纯骨折组相比,骨折合并脑损伤组大鼠骨折愈合加速,骨痂中骨形态发生蛋白2和胰岛素样生长因子1的表达显著性升高,提示脑损伤促进了骨折愈合的机制可能与此有关。

摘要：背景:在内耳毛细胞发育中,胰岛素样生长因子1是重要的促有丝分裂因子,也是不可缺少的调节因子。细胞外信号调节激酶1/2在哺乳动物前庭器官也有表达。目的:观察庆大霉素损伤后豚鼠前庭上皮胰岛素样生长因子1及其受体、细胞外信号调节激酶1/2的表达和分布变化。设计:随机对照实验。单位:解放军成都军区总医院耳鼻喉科。材料:选用健康成年豚鼠20只,体质量300～350g,由解放军第四军医大学实验动物中心提供。按随机数字表法分为对照组(n=4)和实验组(n=16),实验组又按停药后1,7,14,21d4个时间点进行观察,每个时间点4只。方法:实验于2002-01/2002-05在解放军第四军医大学西京医院耳鼻喉科实验室完成。实验组豚鼠每天腹腔注射庆大霉素80mg/kg,对照组动物每天腹腔注射生理盐水1mL,连续10d。豚鼠出现步态不稳或眼震认为造模成功。每天观察豚鼠的步态、眼震及进食量。分别于停药后1,7,14,21d将实验组动物腹腔注射戊巴比妥50mg/kg过度麻醉后,取出并剪开双侧听泡,去除镫骨底板,固定、脱钙、包埋。取与蜗轴平行方向连续切片。对照组动物于停止注射生理盐水后1d采取相同措施。苏木精-伊红染色观察前庭上皮形态改变,免疫组织化学法观察胰岛素样生长因子1及其受体和细胞外信号调节激酶1/2的表达及分布变化。主要观察指标:①各组动物庆大霉素损伤后行为学和前庭上皮形态学的变化。②胰岛素样生长因子1及其受体、细胞外信号调节激酶1/2的表达及分布变化。结果:纳入的20只豚鼠全部进入结果分析。①庆大霉素注射期间,所有豚鼠的前庭功能均受损,停药后未经任何治疗,其前庭功能均部分恢复。②注射庆大霉素后,前庭上皮形态学改变明显,但停止注射庆大霉素1周后明显改善。③对照组豚鼠胰岛素样生长因子1及其受体有低水平表达,庆大霉素损伤后停药1d其表达最强,之后逐渐下降,但停药后21d其表达仍高于对照组。各组间胰岛素样生长因子1及其受体表达灰度值比较差异明显(F=51.8,45.7,P<0.05)。二者变化规律基本一致。④对照组豚鼠细胞外信号调节激酶1/2有低水平表达。庆大霉素损伤后其表达逐渐增强,停药后7d表达最强,之后逐渐下降,停药后21d其表达仍高于对照组。各组间细胞外信号调节激酶1/2表达比较差异明显(F=103.7,106.4,P<0.05)。二者变化规律相近。结论:庆大霉素损伤后豚鼠前庭上皮胰岛素样生长因子1及其受体,细胞外信号调节激酶1/2表达增加。胰岛素样生长因子1可能是内源性的促有丝分裂剂,通过旁分泌或自分泌的方式在豚鼠前庭毛细胞修复的早期发挥重要作用。细胞外信号调节激酶1/2可能在庆大霉素损伤后豚鼠前庭毛细胞自发修复中发挥重要的信号转导作用。

摘要：背景:前脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化潜力的特异化的前体细胞,如果能够找到可以强力促进前脂肪细胞增殖和分化的因子或药物,在脂肪组织移植的同时使用,则有希望提高脂肪组织的移植效果。目的:摸索体外培养经典的3T3-L1前脂肪细胞的最佳培养环境并积累培养经验,观察胰岛素样生长因子1对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的影响,并探求胰岛素样生长因子1的最佳作用剂量。设计、时间及地点:以细胞为对象的对照观察实验,于2007-10/2008-02在辽宁医学院科学实验中心完成。材料:3T3-L1前脂肪细胞株购于上海中科院生命科学院;胰岛素样生长因子1购于美国Biological公司。方法:根据3T3-L1前脂肪细胞的体外培养条件分为6组:空白对照组应用含体积分数为0.1的胎牛血清的标准高糖DMEM培养基培养;各实验组分别应用含有5,10,20,50,100μg/L胰岛素样生长因子1的含体积分数为0.1的胎牛血清的高糖DMEM培养基培养。主要观察指标:倒置显微镜下观察各组3T3-L1前脂肪细胞的生长、增殖及分化情况并拍照记录。待细胞铺满瓶底达到单层汇合时,应用流式细胞仪检测细胞周期,应用四甲基偶氮唑盐比色法测定3T3-L1前脂肪细胞的增殖率;应用油红O染色提取法测定3T3-L1前脂肪细胞内脂肪含量的增殖率。结果:①倒置显微镜下观察分化前3T3-L1前脂肪细胞呈梭形,胞浆内无脂滴,分化后3T3-L1前脂细胞呈圆形,胞浆内含有大量的脂滴,脂滴聚集于核周,被油红O染成橙红色,形成"戒环"样形态。②四甲基偶氮唑盐比色法和油红O染色提取法检测结果均显示,不同剂量的胰岛素样生长因子1组中3T3-L1前脂肪细胞的增殖率及细胞内脂肪含量的增殖率均高于空白对照组(P<0.05),胰岛素样生长因子120μg/L组对3T3-L1前脂肪细胞的增殖、分化作用最为明显(P<0.05);流式细胞仪的分析结果与四甲基偶氮唑盐比色法及油红O染色提取法的检测结果基本一致。结论:体外细胞培养实验表明,胰岛素样生长因子1对3T3-L1前脂肪细胞的增殖、分化有明显促进作用,其促进作用与浓度并非成正比,而是达到一定剂量后,其促进作用不再增加,而这个剂量接近本实验的最佳剂量值,即20μg/L。

摘要：背景:单基因诱导虽能对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化产生积极影响,但作用有限,多种基因共同作用才符合机体真实内环境的需求,并有助于发挥多基因产物之间的协同作用,提高分化效果。目的:验证应用SOX-9和胰岛素样生长因子1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果。设计、时间及地点:两样本观察,实验于2008-04/2009-02在中国医科大学细胞生物实验室完成。对象:6周龄健康雄性Wistar大鼠2只用于骨髓间充质干细胞提取。方法:扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9。分离、纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞。按转染情况分为5组:①未转染组:仅加入双无(无血清无双抗)L-DMEM。②转染空载体组:双无L-DMEM+pcDNA3.1空载体和脂质体。③转染SOX-9组:双无L-DMEM+pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体。④转染胰岛素样生长因子1组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1质粒和脂质体。⑤共转染组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体,混合。主要观察指标:对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测筛选后细胞目的基因和蛋白的表达。结果:MTT法检测转染SOX-9组、转染胰岛素样生长因子1组和共转染组骨髓间充质干细胞增殖活性A值显著高于未转染组、转染空载体组(P<001)。反转录-聚合酶链反应和Western blot检测目结果显示,SOX-9表达以转染SOX-9组最多;胰岛素样生长因子1表达以共转染组最多;软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原表达以共转染组最多。结论:双基因转染在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的能力和细胞外基质分泌的能力上更明显高于单基质转染;另外结果间接说明胰岛素样生长因子1具有诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用,但能力弱于SOX-9。

摘要：背景:多项研究已证实嗅鞘细胞能促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复,但其分子机制还不清楚。目的:观察嗅鞘细胞移植对脊髓全横断大鼠大脑运动皮质神经营养因子胰岛素样生长因子1和睫状神经营养因子mRNA表达的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-07/2008-12在昆明医学院神经科学研究所完成。材料:清洁级健康成年雌性SD大鼠88只,随机分成3组:假手术组8只、模型组40只、细胞移植组40只。另取新生一两天的GFP转基因小鼠5只用于分离培养嗅鞘细胞。方法:模型组、细胞移植组大鼠建立T9脊髓全横断损伤模型,假手术组仅行T8椎板切除。造模后,细胞移植组吸取嗅鞘细胞悬液15μL(约3×105个细胞)滴加到约2mm3的明胶海绵上,将含有嗅鞘细胞的明胶海绵植入大鼠脊髓两横断面之间的间隙处。分别于移植后3,7,14,21,28d取大脑运动皮质行RT-PCR检测。主要观察指标:采用免疫细胞化学法对培养的嗅鞘细胞进行鉴定,RT-PCR法检测大脑运动皮质胰岛素样生长因子1和睫状神经营养因子mRNA的表达变化。结果:培养的嗅鞘细胞p75-NGFR阳性率>90%,主要为双极细胞,突起较长。与假手术组比较,模型组术后3d睫状神经营养因子表达明显升高,7,14,21d降至无明显差异,至28d明显降低(P0.05)。与模型组比较,移植后14d细胞移植组胰岛素样生长因子1表达明显增多(P<0.05);移植后3d睫状神经营养因子的表达明显减少(P<0.05),但移植后7,14,21d表达逐渐回升,至28d明显高于模型组水平(P<0.05)。结论:嗅鞘细胞移植能够促进脊髓损伤修复,其机制可能与促进大脑运动皮质胰岛素样生长因子1mRNA的表达上调,并在初期抑制睫状神经营养因子mRNA的表达有关。

摘要：目的:探讨人食管癌EC9706细胞中胰岛素样生长因子1受体的表达,及其对反义寡核苷酸胰岛素样生长因子1受体mRNA表达的影响和食管癌发生、转移的意义。方法:实验于2004-09/12在河南省肿瘤病理重点实验室完成。体外分5组培养人食管癌EC9706细胞,其中4组分别用设计合成的3条封闭胰岛素样生长因子1受体不同基因位点的反义寡核苷酸1～3及1条无关寡核苷酸转染,另一组不转染。采用完整细胞原位杂交技术观察各组EC9706细胞中胰岛素样生长因子1受体mRNA表达情况。结果:①胰岛素样生长因子1受体mRNA在食管癌EC9706细胞中呈阳性表达。②3条胰岛素样生长因子1受体反义寡核苷酸转染组EC9706细胞中胰岛素样生长因子1受体mRNA的表达无差异(2.66&#177;0.21,2.63&#177;0.23,2.65&#177;0.22,P>0.05),但均显著低于无关寡核苷酸组及无转染组(5.67&#177;2.86,5.02&#177;2.75,P<0.05)。结论:胰岛素样生长因子1受体反义寡核苷酸转染人食管癌EC9706细胞后,可体外抑制EC9706细胞中胰岛素样生长因子1受体mRNA的表达,从而抑制食管癌的发生和转移。为临床预防食管癌的发生、发展和转移提供了理论依据。