摘要：背景:研究认为衰老和光老化状态下生长因子的表达不一定一致,生长因子与皮肤老化的关系越来越受到重视。目的:验证转化生长因子β1对长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞胰岛素样生长因子1、角质细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子表达的影响。设计、时间及地点:以体外培养细胞为观察对象,随机重复实验,于2006-07/2008-03在解放军第四军医大学全军整形外科研究所进行。材料:成纤维细胞来自解放军第四军医大学整形外科门诊患者包皮,采用组织块法培养获得。方法:通过酶联免疫法(ELISA)使用不同剂量长波紫外线(0,5,10,20J/cm2)照射体外培养的皮肤成纤维细胞,测定上清液中胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子的质量浓度;以长波紫外线15J/cm2为照射剂量,选择不同剂量转化生长因子β1即小剂量组(0.1μg/L)、中剂量组(1μg/L)、大剂量组(10μg/L)对培养的皮肤成纤维细胞进行干预。主要观察指标:不同剂量长波紫外线照射、以及转化生长因子β1处理后皮肤成纤维细胞胰岛素样生长因子1、血管内皮细胞生长因子、角质形成细胞生长因子的表达。结果:长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞导致胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子分泌水平下降,血管内皮细胞生长因子分泌升高;转化生长因子β1处理后,转化生长因子β1剂量依赖性地提高长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞分泌的3种细胞因子的水平。转化生长因子β1大剂量组胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子含量明显高于长波紫外线照射组(P<0.01)。结论:长波紫外线照射抑制体外培养成纤维细胞中胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子表达,促进血管内皮细胞生长因子表达。转化生长因子β1可提高长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞分泌胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子3种细胞因子的水平,有利于真皮内结构的恢复和重建。

摘要：背景:前脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化潜力的特异化的前体细胞,如果能够找到可以强力促进前脂肪细胞增殖和分化的因子或药物,在脂肪组织移植的同时使用,则有希望提高脂肪组织的移植效果。目的:摸索体外培养经典的3T3-L1前脂肪细胞的最佳培养环境并积累培养经验,观察胰岛素样生长因子1对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的影响,并探求胰岛素样生长因子1的最佳作用剂量。设计、时间及地点:以细胞为对象的对照观察实验,于2007-10/2008-02在辽宁医学院科学实验中心完成。材料:3T3-L1前脂肪细胞株购于上海中科院生命科学院;胰岛素样生长因子1购于美国Biological公司。方法:根据3T3-L1前脂肪细胞的体外培养条件分为6组:空白对照组应用含体积分数为0.1的胎牛血清的标准高糖DMEM培养基培养;各实验组分别应用含有5,10,20,50,100μg/L胰岛素样生长因子1的含体积分数为0.1的胎牛血清的高糖DMEM培养基培养。主要观察指标:倒置显微镜下观察各组3T3-L1前脂肪细胞的生长、增殖及分化情况并拍照记录。待细胞铺满瓶底达到单层汇合时,应用流式细胞仪检测细胞周期,应用四甲基偶氮唑盐比色法测定3T3-L1前脂肪细胞的增殖率;应用油红O染色提取法测定3T3-L1前脂肪细胞内脂肪含量的增殖率。结果:①倒置显微镜下观察分化前3T3-L1前脂肪细胞呈梭形,胞浆内无脂滴,分化后3T3-L1前脂细胞呈圆形,胞浆内含有大量的脂滴,脂滴聚集于核周,被油红O染成橙红色,形成"戒环"样形态。②四甲基偶氮唑盐比色法和油红O染色提取法检测结果均显示,不同剂量的胰岛素样生长因子1组中3T3-L1前脂肪细胞的增殖率及细胞内脂肪含量的增殖率均高于空白对照组(P<0.05),胰岛素样生长因子120μg/L组对3T3-L1前脂肪细胞的增殖、分化作用最为明显(P<0.05);流式细胞仪的分析结果与四甲基偶氮唑盐比色法及油红O染色提取法的检测结果基本一致。结论:体外细胞培养实验表明,胰岛素样生长因子1对3T3-L1前脂肪细胞的增殖、分化有明显促进作用,其促进作用与浓度并非成正比,而是达到一定剂量后,其促进作用不再增加,而这个剂量接近本实验的最佳剂量值,即20μg/L。

摘要：目的 :实现含人类胰岛素生长因子I(hIGF - 1)融合蛋白的高水平可溶性表达和纯化 ,应用factorXa获得非融合的hIGF - 1,并对提高目的融合蛋白对factorXa的敏感性进行探索。方法 :根据大肠杆菌偏爱密码子设计并合成编码 70个氨基酸的hIGF - 1基因 ,克隆到表达载体pET - 35b(+) ,实现hIGF - 1与纤维素结合域 (cellulosebindingdomain ,CBD)的融合表达 ,并在两者之间引入factorXa的识别位点 ,同时尝试在factorXa识别位点前引入 7个氨基酸的柔性短肽 (Gly -Thr-Gly -Gly-Gly -Ser -Gly) ,比较factorXa酶切效率。纤维素亲和层析纯化融合蛋白CBD -IGF ,经Westernblotting检测后 ,利用MTT法测定其促进NIH3T3细胞增殖的活性。结果 :可溶性融合蛋白CBD-IGF在大肠杆菌中高效表达 ;活性测定结果显示所纯化的融合蛋白具有促进 3T3细胞增殖的活性。在factorXa识别位点前引入柔性短肽后提高了融合蛋白对factorXa的敏感性。结论 :实现有活性的融合蛋白CBD -IGF在大肠杆菌中可溶性的高效表达 ,为高效制备hIGF - 1基因工程产品奠定了基础。此外 ,在factorXa识别位点前引入柔性短肽有效提高融合蛋白CBD -IGF对factorXa的敏感性。

摘要：背景:慢性肝病是骨质疏松的危险因素之一,目前对慢性肝病合并骨质疏松的药物治疗研究较少。对于骨质疏松患者来说,常需口服钙剂治疗,但是单独应用钙剂的治疗效果并不好。而骨质疏松合并肝硬化的患者,体内维生素D相对缺乏,会出现骨质软化及内分泌紊乱。降钙素作为重要的钙磷调节激素,可降低血钙和血磷,进一步促进成骨分化。目的:试验观察了鲑鱼降钙素联合钙剂治疗病毒性肝硬化合并骨质疏松的疗效及安全性。方法:研究为前瞻性、单中心、开放性、随机、平行、对照、2年随访临床试验。纳入中国山东,滨州医学院烟台附属医院门诊及住院的病毒性肝硬化合并骨质疏松症患者102例,随机分为2组,对照组51例给予口服钙剂治疗,联合治疗组51例肌肉注射鲑鱼降钙素联合口服钙剂进行治疗,共治疗24个月。研究的主要结局指标为治疗后24个月L_(2-4)的骨密度值与基线的变化值,研究的次要结局指标为治疗前、治疗后6,12个月L_(2-4)的骨密度值;治疗后6,12,24个月股骨颈及Ward’s三角区骨密度值;治疗前、治疗后6,12,24个月的血清钙,磷,1,25(OH)_2D_3,甲状旁腺素、骨钙素、白细胞介素10、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和胰岛素样生长因子1水平;治疗后6,12,24个月的不良反应发生率。试验经滨州医学院烟台附属医院医学伦理委员会批准(审批单位:滨州医学院烟台附属医院,审批时间:2018年7月,审批号:2018071601)。研究符合世界医学会制定的《赫尔辛基宣言》的要求;参与者本人对试验方案和过程均知情同意,并签署知情同意书;试验设计时间为2018年3月,试验于2018年10月开始招募患者及数据收集,2019年10月完成对象招募,2022年1月进行结果指标分析,2022年2月完成试验;文章结果将以科学会议报道,或在同行评议的期刊上发表传播。试验已在中国临床试验注册中心注册(注册号:Chi CTR1800017732),注册方案版本号1.0。结果与结论:课题组目前已经发表了64例患者的预试验结果,随访12个月发现,与对照组32例口服钙剂相比,治疗组32例肌肉注射鲑鱼降钙素联合口服钙剂患者的血清钙、1,25(OH)_2D_3、白细胞介素10、胰岛素样生长因子1及L_(2-4)、股骨颈及Ward’s三角区骨密显著升高(P<0.05);血清磷、甲状旁腺素及骨钙素、白细胞介素6及肿瘤坏死因子α均显著降低(P <0.05)。试验旨在验证,鲑鱼降钙素联合钙剂是一种治疗病毒性肝硬化合并骨质疏松症的合适方法,临床数据可以证实其可以显著提高腰椎及髋部骨密度,改善骨生化指标,减少不良反应发生率,长期疗效较好。

摘要：探讨末梢全血和静脉血清检测儿童胰岛素样生长因子1(IGF-1)和胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)的一致性。本研究为横断面设计,纳入2022年1至4月在南京医科大学附属儿童医院儿童保健科健康体检的0~14岁儿童,同时收集末梢全血和静脉血清样本,应用化学发光免疫分析法(CLIA)分别检测两种样本的IGF-1和IGFBP-3水平。采用线性回归方程分析两种样本检测结果之间的相关性,并运用组内相关系数(ICC)评估两种样本检测结果的一致性,以及分析IGF-1和IGFBP-3随年龄的变化趋势。结果显示,共收集匹配有效样本203例(男117名,女86名)。末梢全血和静脉血清IGF-1(r=0.986,P<0.001)、IGFBP-3(r=0.974,P<0.001)相关良好,直线回归方程式分别为:IGF-1_(静脉血清)=1.047×IGF-1_(末梢全血)-6.840,IGFBP-3_(静脉血清)=0.924×IGFBP-3_(末梢全血)+0.396。按性别和年龄分层后相关性和一致性依然存在。ICC分析表明,IGF-1和IGFBP-3的单一量度ICC分别为0.983和0.967,一致性良好。男女童末梢全血和静脉血清IGF-1与IGFBP-3在各年龄组差异有统计学意义(P均<0.001),均随年龄增加而显著上升(P_(趋势)均<0.001)。综上,末梢全血和静脉血清检测IGF-1和IGFBP-3的结果具有较好的可比性,其水平可以互认。检测末梢血IGF-1和IGFBP-3在低龄儿童领域有较大的应用潜力,可为低龄儿童的营养干预、生长发育评估等提供辅助指导。

摘要：背景：单纯应用差速贴壁法获得的原代肌源性干细胞数量少,生长速度较慢,不利于获取满足实验及将来临床所需的细数量。目的：观察碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子1在体外对体外培养肌源性干细胞增殖的作用,探索体外大量养肌源性干细胞的方法和条件。设计、时间及地点：观察对比实验,于2007-09/2008-04在武汉大学人民医院泌尿外科实验室完成。材料：2周龄体质量50-80g的SD大鼠20只。方法：采用改良差速贴壁培养法分离大鼠骨骼肌肌源性干细胞：取新生大鼠肌肉标本分离细胞;维持总的贴壁时间基本变,减少贴壁次数,取第2代肌源性干细胞进行体外成肌分化。主要观察指标：以免疫细胞化学法及免疫荧光法鉴定肌源性干细胞。以MTT比色实验检测5,10,20,40,80μg/L碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1及胰岛素样生长因子1＋碱性成纤维细胞生长因子对肌源性干细胞增殖的响。以流式细胞仪检测碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1和胰岛素样生长因子1＋碱性成纤维细胞生长因子细胞周期的影响。结果：肌源性干细胞原代培养70h后开始贴壁,呈规则的圆形。1周后细胞数量增多,细胞展开呈纺锤性。免疫细胞化染色法和细胞免疫荧光法显示肌源性干细胞呈结蛋白、干细胞抗原1和CD34阳性。传代细胞加入碱性成纤维细胞生长子、胰岛素样生长因子1后肌源性干细胞的增殖活性增强,两种细胞因子作用强度相近,随着两种细胞因子浓度的提高细胞增殖作用逐渐提高,在达到有效浓度后作用趋于饱和。两种细胞因子作用机制不同,碱性成纤维细胞生长因子主要是加G2M期的细胞比例,通过缩短细胞周期达到增殖作用,胰岛素样生长因子1则主要增加S期细胞的比例,通过活化G0期到G1期转化的进入有丝分裂细胞来达到增殖作用。结论：胰岛素样生长因子1和碱性成纤维细胞生长因子都具有刺激肌源性干细胞增殖的作用,两者联合作用既可以增加期由G0期进入G1期的数量,又可以减短细胞有丝分裂周期,从而达使促增殖效果更快、更强。

摘要：目的探讨牛奶对金黄地鼠皮脂分泌的影响及作用机制。方法将18只金黄地鼠随机分为3组,每组6只。空白组不予任何干预措施,全脂牛奶组予全脂牛奶灌胃,脱脂牛奶组予脱脂牛奶灌胃,2.5 ml/次,2次/d,连续4周;于干预开始后第0、7、14、21、28天测量金黄地鼠双侧皮脂腺斑最大横径及纵径,计算皮脂腺斑的面积;末次灌胃24 h后剪下各组金黄地鼠双侧皮脂腺斑组织,采用免疫组化法检测皮脂腺斑胰岛素样生长因子1(IGF-1)/固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)/乙酰辅酶A羧化酶(ACC-1)信号通路表达水平。采用重复测量方差分析、成组设计的单因素方差分析、Kruskal-Wallis H检验进行统计学分析,两两比较采用LSD-t检验。结果重复测量方差分析显示,金黄地鼠各组间皮脂腺斑面积差异无统计学意义(F=0.96,P=0.417)。脱脂牛奶组IGF-1表达(0.39±0.03)显著高于空白组(0.35±0.03)及全脂牛奶组(0.33±0.02),差异均有统计学意义(t值分别为2.62、3.82,P值分别为0.021、0.002);与空白组(0.36±0.02)相比,脱脂牛奶组SREBP-1表达显著升高(0.42±0.04,t=2.64,P=0.021);与空白组ACC-1表达(0.34±0.03)相比,全脂牛奶组(0.40±0.03)及脱脂牛奶组(0.40±0.05)均显著升高(t值分别为2.39、2.47,P值分别为0.031、0.026)。结论牛奶可能通过IGF-1/SREBP-1/ACC-1信号通路促进金黄地鼠皮脂分泌。

摘要：【目的】克隆梅花鹿(Cervus nippon)胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)的成熟肽基因,并对其进行原核表达及纯化,以获得具有生物学活性的蛋白,为研究IGF-1在梅花鹿鹿茸生长发育中的调控作用及机理提供参考。【方法】以GenBank中的梅花鹿IGF-1基因序列(登录号:HQ890468)设计1对引物,以构建的梅花鹿pMD-18T-IGF-1重组质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽的基因序列,构建重组质粒pMD-IGF-1,将其插入pET-32a表达载体后,构建pET-32a-IGF-1质粒,鉴定后,将pET-32a-IGF-1转入Rosetta大肠杆菌进行诱导表达(0.6mmol/L IPTG,37℃,4h)后,对其表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测。用Ni-Agarose柱亲和层析试剂盒分离、羟胺裂解纯化目标蛋白,并利用四唑盐比色法(MTT法)和流式细胞仪检测目标蛋白对NIH3T3细胞增殖及不同细胞周期下NIH3T3细胞比例的影响。【结果】获得了梅花鹿IGF-1成熟肽基因序列(234bp);经鉴定,原核表达载体pET-32a-IGF-1构建成功;SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,在Rosetta中成功诱导表达了融合蛋白,且羟胺裂解纯化后的目的蛋白纯度较高;MTT法和细胞周期检测结果表明,复性后的IGF-1重组蛋白能促进细胞增殖。【结论】成功克隆了梅花鹿IGF-1成熟肽基因序列,获得了具有生物学活性的IGF-1蛋白。

摘要：为了检测梅花鹿鹿茸组织IGF1基因的mRNA表达水平,利用TRIzol试剂法分别提取鹿茸真皮、间充质、前软骨和软骨组织总RNA,逆转录合成cDNA。根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿IGF1基因特异引物并克隆IGF1基因,将IGF1基因DNA序列递交GenBank,并利用相对荧光定量Real-time PCR法检测IGF1在鹿茸顶端不同部位组织的转录表达丰度。研究结果表明:成功获得了梅花鹿鹿茸组织IGF1基因全长编码区cDNA(GenBank登录号为HQ890468),该基因长465 bp,编码154aa长度的多肽;与马鹿、牛、羊、马、猪、人和小鼠IGF1基因进行同源性分析显示,IGF1基因与马鹿、牛和羊同源性最高,核苷酸序列分别为99.78%、98.28%和97.85%;氨基酸序列分别为99.35%、98.05%和97.40%。相对荧光定量PCR差异分析发现,IGF1基因在鹿茸顶端不同部位组织均有表达。其中,在前软骨和软骨组织的表达水平明显高于真皮和间充质组织。

摘要：【目的】构建靶向梅花鹿胰岛素样生长因子1基因(IGF1)的microRNA真核表达载体,研究microRNA介导的IGF1基因沉默对鹿茸软骨细胞增殖的影响。【方法】根据IGF1mRNA序列设计并合成4对premicroRNA前体片段,定向克隆于pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体中,构建重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-1、pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2、pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-3和pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-4;测序分析插入序列的完整性,将重组质粒转染鹿茸软骨细胞,利用相对荧光定量PCR技术检测IGF1mRNA的表达量;在此基础上选择表达量最低的pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR重组质粒转染鹿茸软骨细胞,Western blotting分析IGF1蛋白的表达水平,MTT法和流式细胞仪检测重组质粒对鹿茸软骨细胞体外增殖和细胞周期的影响。【结果】测序结果显示,构建的4组重组质粒插入片段的碱基序列完全正确。转染pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR重组质粒后,鹿茸软骨细胞中IGF1mRNA的表达水平均有所下降,其中转染重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2组的表达水平最低,因而筛选重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2为最佳干扰质粒。与对照组相比,IGF1蛋白的表达水平降低;重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2转染组鹿茸软骨细胞的增殖受到抑制,细胞周期S期细胞百分比减少,表明鹿茸软骨细胞停滞在G0/G1期。【结论】梅花鹿IGF1的表达水平受miRNA的调控,表明在鹿茸快速生长过程中,miRNA具有重要的调控作用。