摘要：目的研究内质网应激在D-氨基半乳糖／脂多糖联合注射诱导小鼠急性肝衰竭致病机制中的作用。方法以C57BL／6小鼠为研究对象，腹腔注射D-氨基半乳糖／脂多糖建立小鼠急性肝衰竭模型。动物分为对照组、急性肝衰竭模型组、4-丁酸苯酯干预组（建模前6h腹腔注射）。Westemblot方法检测肝组织内质网应激标志物蛋白表达水平，检测血清ALT、AST水平评价肝脏功能，观察肝脏组织病理学变化评价肝脏损伤情况，实时荧光定量PCR检测肝细胞炎症因子如肿瘤坏死因子（TNF）α、白细胞介素（IL）-6和IL-1β基因表达情况，凋亡细胞原位末端转移酶标记试验法检测肝细胞凋亡情况。多组间均数比较采用单因素方差分析，两样本均数比较采用成组设计t检验；对于小鼠的生存分析，应用两两比较的Logrank检验。结果Westernblot方法结果显示，内质网应激蛋白标志物葡萄糖调节蛋白78和葡萄糖调节蛋白94随着急性肝衰竭的进展表达水平逐渐升高；非折叠蛋白反应蛋白1型内质网跨膜蛋白激酶1α、X盒结合蛋白1、活化转录因子6在急性肝衰竭早期被激活，而内质网应激诱导的凋亡蛋白CCAAT／增强子结合蛋白同源蛋白和caspasel2在急性肝衰竭晚期表达升高。4-丁酸苯酯抑制内质网应激可显著改善肝炎症[ALT：（1227．7±301．1）u／L与（727．5±412．5）u／L，P〈0．05；AST：（1682．9±580．2）u／L与（744．9±267．5）U／L，P〈0．051，并且抑制炎症因子的表达（TNFα：1．55±0．47与0．63±0．20，P〈0．05；IL-1β：7．39±2．03与4．51±1．44，P〈0．05；IL-6：0．43±0．14与0．18±0．03，P〈0．05）；凋亡细胞原位末端转移酶标记试验和Westemblot方法研究结果表明，4-丁酸苯酯干预内质网应激可显著抑制肝细胞凋亡，并降低了剪切型caspase3表达。结论内质网应激在D-氨基半乳糖／脂多糖诱导小鼠急性肝衰竭过程中承担着关键作用，抑制内质网应激通过降低炎症反应和肝细胞凋亡从而改善肝损伤。

摘要：目的 探讨短链脂肪酸（SCFA）对内毒素/脂多糖（LPS）引起的人肠上皮细胞屏障功能损害的作用及相关机制。方法 建立人肠上皮细胞株Caco-2单层细胞培养模型。取细胞按随机数字表法分为对照组、LPS组及SCFA＋LPS组。对照组细胞仅采用DMEM培养液常规培养，LPS组细胞在DMEM培养液中另加入终质量浓度为10 μg/mL的LPS，SCFA＋LPS组细胞在DMEM培养液中另加入终质量浓度为10 μg/mL的LPS和SCFA（由0.5 mmol/L乙酸、0.01 mmol/L丙酸、0.01 mmol/L丁酸组成）的混合液培养。于培养0、1、2、6、12、24 h，取细胞采用电阻测定仪测定细胞的跨上皮电阻（TER），样本数为72。另取细胞同前分组及处理后，采用蛋白质印迹法于培养24 h后检测带状闭合蛋白1（ZO-1）、咬合蛋白及闭合蛋白1表达，样本数为6。另取细胞同前分组及处理后，采用免疫荧光法检测细胞形态及ZO-1的分布。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验及Bonferroni校正。结果 （1）与对照组相比，LPS组细胞培养1-24 h的TER均明显降低（P〈0.01），SCFA＋LPS组细胞培养1-24 h的TER无明显变化（P〉0.05）。SCFA＋LPS组细胞培养1-24 h的TER均较LPS组明显升高（P〈0.01）。（2）与对照组的1.25±0.10、1.17±0.04、1.24±0.20相比，LPS组细胞培养24 h ZO-1、咬合蛋白及闭合蛋白1的表达量（0.74±0.23、0.76±0.11、0.77±0.11）均明显降低（P〈0.05），而SCFA＋LPS组细胞培养24 h ZO-1、咬合蛋白及闭合蛋白1的表达量（1.23±0.46、1.05±0.09、1.01±0.13）均与之相近（P〉0.05）。与LPS组相比，SCFA＋LPS组细胞培养24 h的咬合蛋白和闭合蛋白1表达量均明显增加（P〈0.05），ZO-1表达量增加但差异无统计学意义（P〉0.05）。（3）培养24 h对照组细胞排列紧密，近似鹅卵石样外观；ZO-1沿细胞膜呈连续、规则排列。LPS组细胞排列稀疏且形态改变；ZO-1沿细胞膜不规则排列，且偶有断裂和卷曲。SCFA＋LPS组细胞形态和ZO-1排列均较LPS组明显改善。结论 SCFA可通过阻断LPS引起的TER下降、紧密连接蛋白表达下降和ZO-1分布异常，从而减轻LPS对人肠上皮细胞屏障的损害。

摘要：背景:星形胶质细胞是中枢神经系统中分布最广泛的细胞之一,但其在中枢神经退行性疾病中的作用目前尚未明确。目的:观察脂多糖对星形胶质细胞内钙离子、活性氧、一氧化氮水平和细胞存活率的影响。设计:观察对比实验。单位:苏州大学附属第二医院脑循环研究室。材料:实验于2005-05/2005-08在苏州大学附属第二医院脑循环研究室完成,选择8只新生1～3d内SD乳鼠,雌雄不限,由苏州大学动物中心提供,[许可证号:SYXK(苏)2002-0037];脂多糖(Sigma公司),MTT和一氧化氮测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司)。方法:参照***等人的方法体外分离培养新生大鼠皮质星形胶质细胞,经反复传代培养和纯化后,根据加入脂多糖剂量的不同将星形胶质细胞分为5组:空白对照组、脂多糖5mg/L组、脂多糖10mg/L组、脂多糖20mg/L组和脂多糖40mg/L组,脂多糖对星形胶质细胞的作用时间为30min和60min。MTT法测脂多糖作用细胞30min和60min细胞存活率;Griess法测量脂多糖作用细胞30min上清液一氧化氮的含量;采用激光共聚焦显微镜观察不同剂量脂多糖作用细胞30min对离体大鼠星形胶质细胞内钙离子、作用细胞60min时活性氧水平的影响,采用相对荧光强度百分比表示星形胶质细胞内钙离子浓度的变化及细胞释放活性氧的水平。主要观察指标:各组星形胶质细胞存活率;星形胶质细胞上清液中一氧化氮的含量;激光共聚焦显微镜下星形胶质细胞内游离钙和活性氧水平的变化。结果:①脂多糖作用星形胶质细胞60min时,脂多糖5mg/L,10mg/L,20mg/L组的细胞存活率均升高,与对照组相比差异均有显著性(P<0.05),脂多糖10mg/L组的细胞存活率高于脂多糖5mg/L组和脂多糖20mg/L组。②脂多糖40mg/L作用细胞30min后引起一氧化氮水平的升高,与对照组和其余3个剂量组相比差异有显著性(P<0.05)。③脂多糖5mg/L,10mg/L,20mg/L组细胞内游离钙的相对荧光强度是其相应的基础状态的200～400倍,脂多糖40mg/L组的荧光强度是其相应的基础状态的1000倍作用;④脂多糖5mg/L,10mg/L组,20mg/L组的活性氧水平是其基础状态的200～300倍,而脂多糖40mg/L组的绝对荧光强度峰超过了检测的范围,推测脂多糖40mg/L组的活性氧水平至少是相应基础状态的300～400倍。结论:脂多糖作用于星形胶质细胞后可使其胞钙离子浓度升高,活性氧和一氧化氮释放增加,促进细胞增殖。

摘要：目的:探讨辣椒素对脂多糖(LPS)刺激后小鼠主动脉内皮细胞活化的影响,并探讨其可能机制。方法:(1)体外分离培养小鼠主动脉内皮细胞,免疫荧光鉴定内皮细胞特异性标志。(2)以100μg/L LPS作用于血管内皮细胞后,以不同浓度的辣椒素(50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L)进行干预,分别于12、24和48 h收集主动脉血管内皮细胞及细胞上清液。采用ELISA法检测各组细胞上清液中的可溶性细胞间黏附分子1(sICAM-1)、可溶性血管细胞黏附分子1(sVCAM-1)和可溶性P-选择素(sP-selectin)水平,Western blotting法检测各组主动脉血管内皮细胞核内NF-κB p65水平和胞浆p-IκBα、IκBα水平。结果:与对照组相比,LPS组细胞上清液中sP-selectin、sICAM-1和sVCAM-1含量显著升高(P<0.05),LPS能够时间依赖性上调sICAM-1和sVCAM-1的含量。与同时点的LPS组相比,辣椒素能够剂量依赖性下调sP-selectin、sICAM-1和sVCAM-1水平。与对照组相比,LPS作用24 h后,细胞核内NF-κB p65和胞浆p-IκBα蛋白水平显著升高(P<0.05),胞浆IκBα蛋白水平显著降低(P<0.05)。与同时点LPS组相比,辣椒素能够剂量依赖性下调细胞核内NF-κB p65和胞浆p-IκBα蛋白的水平(P<0.05),剂量依赖性上调胞浆IκBα蛋白水平(P<0.05)。结论:辣椒素能够显著抑制LPS作用后血管内皮细胞活化水平,该效应可能是通过下调IκBα降解和NF-κB p65胞核内转位而实现的。

摘要：目的构建针对Toll样受体(TLR)4mRNA的小发夹结构RNA(shRNA)真核表达载体pEGFP-siRNA/TLR4,检测该shRNA诱导的RNA干扰(RNAi)对脂多糖刺激RAW264·7细胞分泌炎症因子的抑制作用,以探讨针对TLR4基因的RNAi对RAW264·7细胞炎症反应的抑制作用。方法构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及shRNA克隆位点的质粒pEGFP-H1/siRNA,运用网络工具siRNAWizard(http://www·sirnawizard·com/)设计针对TLR4mRNA的寡核苷酸片段。将其克隆入pEGFP-H1/siRNA,构建表达EGFP及TLR4-shRNA的真核表达质粒pEGFP-H1/TLR4-siRNA。运用脂质体转染技术将pEGFP-H1/TLR4-siRNA转染至培养的小鼠巨噬细胞系RAW264·7,观察细胞系中荧光蛋白的表达强度;再运用脂多糖刺激转染的RAW264·7细胞,运用ELISA方法检测该细胞系分泌炎症因子水平的变化。结果质粒pEGFP-H1/siRNA及pEGFP-H1/TLR4-siRNA分别用BbsⅠ和MluⅠ酶切电泳后,前者出现4·9kb和340bp的的条带,后者出现5·0kb和220bp的条带,与实验设计的质粒长度一致,且测序证实克隆序列正确。将pEGFP-H1/TLR4-siRNA转染至RAW264·7细胞后,EGFP的表达率为50%±8%。用脂多糖刺激后,TLR4-SiRNA转染组细胞培养液TNF-α水平(2h:825pg/ml±136pg/ml;8h:2190pg/ml±359pg/ml)明显低于对照siRNA转染组(2h:1179pg/ml±240pg/ml;8h:4720pg/ml±227pg/ml,均P<0·01)。结论针对TLR4mRNA的shRNA可能通过RNAi机制对脂多糖诱导的RAW264·7细胞炎症因子的分泌有明显的抑制作用。

摘要：目的:研究内毒素血症发生时多种脂多糖(LPS)相关蛋白在LPS转运及活化中的调节作用。方法:培养佛波醇酯(PMA)诱导分化的THP-1细胞。选取LPS、脂多糖结合蛋白(LBP)、可溶性CD14(sCD14)、杀菌/渗透增强蛋白(BPI)、高密度脂蛋白(HDL)5因素2水平采用L16(215)正交设计。配制实验体系,培养4 h后,留取上清液,发光法检测TNF-α分泌量。结果:混合体系中,BPI和HDL存在负向效应,LBP、LPS和sCD14存在正向调节效应。TNF-α分泌量与sCD14、BPI的单独主效应有关(P<0.05),并与LBP和sCD14、LBP和HDL、LPS和LBP的交互作用有关(P<0.05)。结论:在体内多种相关蛋白同时存在时,LPS对单核巨噬细胞的活化与sCD14、BPI的单独效应有关,并与LBP和sCD14、LBP和HDL、LPS和LBP交互作用有关。

摘要：目的观察热性惊厥(FS)幼鼠海马神经细胞凋亡数变化,为探讨幼鼠FS脑损伤机制及寻求有效的防治措施提供理论依据。方法按析因设计,64只14日龄SD幼鼠随机均分为4组(n=16),即对照组:生理盐水(NS)组;试验组:脂多糖(LPS)+海人藻酸(KA)组;KA组;LPS组。采用LPS联合低剂量KA腹腔注射的方法诱导幼鼠FS。H-E染色观察幼鼠海马神经元显微结构的改变,TUNEL法检测海马神经细胞凋亡数的变化。结果 LPS+KA组16只幼鼠均出现FS,发作时肛温为(39.3±0.4)℃;其他组幼鼠均未出现FS。LPS+KA组、LPS组、KA组及NS组幼鼠末次腹腔注射后24h,海马CA1区神经细胞凋亡数分别为(20.63±3.78),(11.63±3.58),(4.06±2.86)及(3.06±2.01),48h分别为(20.63±1.69),(12.25±3.62),(5.50±3.06)及(3.19±1.98)。FS持续时间与海马细胞凋亡程度呈正相关(r=0.866,P<0.01)。结论 LPS联合低剂量KA腹腔注射诱导FS可导致幼鼠海马神经细胞损伤。

摘要：目的对本院分离鉴定的1株人苍白杆菌进行16srRNA基因序列分析以及脂多糖内毒素活性和外膜蛋白免疫性的初步研究。方法采用自行设计的引物对菌株做PCR扩增和16srRNA基因序列测定;用酚水法提取脂多糖作相关生物学活性试验;提取外膜蛋白组分免疫动物,观察其对羊布氏杆菌是否有交叉保护作用。结果本院分离的人苍白杆菌与购自美国苍白杆菌ATCC菌株和购自北京的羊布氏杆菌之间核苷酸序列具有高度同源性((98%);人苍白杆菌脂多糖具有内毒素生物学活性,但较大肠埃希菌脂多糖为弱;以人苍白杆菌外膜蛋白免疫小鼠不能抵御布氏杆菌的攻击。结论我院分离的人苍白杆菌在遗传学上与羊布氏杆菌具有非常密切的亲缘关系,但其外膜蛋白组分对羊布氏杆菌无交叉保护作用。人苍白杆菌脂多糖具有内毒素的活性,可能是一种重要的致病因子,但其毒性低于大肠埃希菌脂多糖。

摘要：近年研究表明,DNA和RNA不仅起遗传信息储存和传递的作用,而且可以通过自身特有的结构与其他类型分子相互作用,以此为基础可以建立人工设计的随机寡核苷酸库,从这类随机序列库中筛选出与靶分子高度特异结合片段的过程,称为指数富集系统进化配体(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),筛选出的分子被称为"核酸适配体",即适体,其作用形式与抗体相似,可与靶分子高亲和力、特异性结合,其解离常数可达到pg级~([4-6]).本实验结果提示,将2个不同适体与内毒素形成高亲和力的三明治结构用于检测内毒素,方法可行,检测线性范围宽,特异性强,灵敏度高,检测信号稳定,重现性好,且不以内毒素为靶目标的无关适体对其没有干扰.另外,液相检测法中采用磁珠分离技术可大大消除非特异性吸附,进一步提高检测效率,敏感度高于固一液相检测法

摘要：背景:衰老大鼠静脉注射脂多糖后能导致肺损伤,进而发现随着肺损伤的进展,影响肾功能。银杏叶提取物具有一定的清除自由基、改善血液流变学和保护血管内皮细胞等功能。目的:研究人工衰老大鼠肺损伤后是否发生肾功能不全,以验证老年多器官功能不全的肺启动机制,并观察银杏叶提取物对其是否有保护作用。设计:以实验动物为观察对象的随机对照的实验。单位:中国协和医科大学基础医学研究所病理生理学系。材料:实验于2001-05/2003-01在中国协和医科大学基础医学研究所病理生理学系实验室完成。选用36只Wistar雄性大鼠。方法:给大鼠每天1次经腹腔注入D-半乳糖(50mg/kg),连续6周,复制衰老动物模型,再随机分为3组:对照组(静脉注射生理盐水);脂多糖组(静脉注射脂多糖,5mg/kg);银杏叶提取物+脂多糖组(注射脂多糖前7d开始,每天银杏叶提取物灌胃1次,31mg/kg)。各组大鼠在给生理盐水或脂多糖后2h或6h取血和肺、肾组织。主要观察指标:用比色法测定血中肌酐、尿素氮含量;血、肺、肾组织中丙二醛、NO2-/NO3-含量及谷胱甘肽过氧化物酶及Na+-K+-ATP酶活性的测定。结果:衰老大鼠在注射脂多糖后2,6h时已形成急性肺损伤。注射脂多糖后2h血中肌酐及尿素氮含量无明显升高,而6h时均显著升高,分别为(94.7±10.3)μmol/L,(11.4±1.9)mmol/L。在注射脂多糖后2h,血和肺组织中丙二醛犤(22.5±2.6)nmol/L,(25.8±2.9)μmol/g犦和NO2-/NO3-含量犤(58.5±6.8)mmol/L,(34.6±3.8)μmol/g犦均显著升高,而谷胱甘肽过氧化物酶犤(355.1±45.0)μkat/g犦及Na+-K+-ATP酶犤(886.3±97.2)nkat/g犦下降。上述指标的变化持续至观察的6h。而肾组织中上述指标仅在注射脂多糖后6h才有显著性变化。银杏叶提取物可显著缓解上述指标的变化。结论:脂多糖所致衰老大鼠的肺损伤可进一步诱导肾功能受损。银杏叶提取物对脂多糖诱发的衰老大鼠的急性肺损伤和由此诱导的肾功能受损有明显的保护作用。