摘要：目的应用自行设计的灌注脱细胞系统制备全膀胱脱细胞基质(BAM),并探讨采用脂肪干细胞(ADSCs)构建组织工程膀胱的可行性。方法本研究于2020年10月至2021年4月进行。采用自行设计的膀胱灌注脱细胞系统,按照灌注液流动方向和不同脱细胞液作用时间的不同,制订4种不同的脱细胞方案(分别为A、B、C、D组)。其中A组和B组均以膀胱组织的尿道口作为灌注液的流出道,C组和D组剪去膀胱顶部部分组织以膀胱顶部开口作为灌注液的流出道。A组和C组采用1%Triton X-100作用6 h,1%十二烷基硫酸钠(SDS)作用2 h;B组和D组采用1%Triton X-100作用7 h,1%SDS作用1 h。另设正常膀胱组作为对照,其组织为直接取材的天然膀胱组织,不需要灌注和冷冻保存。通过HE、DAPI、Masson三色染色和阿尔新蓝染色,以及试剂盒定量分析以筛选出快速且高效的脱细胞方案,制备全膀胱支架。以制备的BAM为支架材料,ADSCs为种子细胞构建组织工程膀胱,HE和DAPI染色观察ADSCs在BAM上的分布情况。结果HE和DAPI染色结果显示C组未见明显的细胞核残留,Masson三色染色和阿尔新蓝染色结果表明C组的胶原结构和糖胺聚糖得到较好保留。C组膀胱壁厚度与正常膀胱组[(975.44±158.62)μm与(1064.49±168.52)μm]差异无统计学意义(P>0.05)。C组DNA含量[(43.59±4.59)ng/mg]明显低于正常膀胱组、A组、B组和D组[分别为(532.50±26.69)、(135.17±6.99)、(182.49±13.69)、(84.00±4.38)ng/mg],差异均有统计学意义(P0.05)。扫描电镜检查结果显示A~D组制备的BAM表面可见大量的孔隙结构,利于细胞黏附。分离培养ADSCs,流式细胞术鉴定证实CD90和CD29阳性表达,CD45和CD106阴性表达。活/死细胞双染色法和CCK-8检测证实C组制备的BAM无细胞毒性。以C组BAM为支架材料构建组织工程膀胱,HE和DAPI染色可见大量ADSCs分布于组织工程膀胱的表面和内部。结论采用自行设计的灌注脱细胞系统制备的全膀胱形态BAM可作为膀胱组织工程的支架材料,构建的组织工程膀胱可用于膀胱修复重建,为进一步临床转化研究提供实验基础。

摘要：背景:骨性关节炎是老年人群中最常见的关节疾病,然而人们尚未研发出可以有效控制甚至逆转疾病进展的疗法。虽然近年应用脂肪干细胞治疗骨性关节炎的临床试验正逐步展开,其安全性和有效性并未经严格论证。目的:归纳总结已完成且已发表与已注册且尚未完成的应用脂肪干细胞治疗骨关节炎的相关临床试验,列举其试验设计,分析其安全性与有效性。Science方法:在Pub Med,Medline,Web of和***中检索发表于2017年12月之前关于脂肪干细胞治疗骨关节炎的相关临床试验文献,纳入标准为脂肪干细胞应用于膝骨关节炎患者的随机对照试验、队列研究或病例系列研究,纳入文献需提供详细试验设计、临床资料与随访结果。结局评价指标包括文献证据等级、受试者入选标准、脂肪干细胞治疗方案、临床随访结果、严重不良事件等。结果与结论:纳入了9项进行中临床试验,列举试验设计以及预期观察结果。纳入了9篇已完成临床试验,其中2篇对照试验,2篇剂量效应研究试验,5篇病例系列报道。结果显示受试者在接受脂肪干细胞治疗后疼痛程度和关节功能等方面有显著改善,未发生严重不良事件,以上临床试验结果证实了脂肪干细胞治疗骨关节炎的有效性与安全性,然而结果显示已完成临床试验证据等级较低。

摘要：研究表明脂肪组织是多潜能干细胞的又一新来源,脂肪组织来源的干细胞可被用于细胞治疗及组织工程。然而,传统的培养方法很难满足临床需求。为获得大量的脂肪干细胞以满足临床需求,现将脂肪干细胞接种到胶原/壳聚糖支架上,比较细胞在静态环境和在转瓶中动态扩增的情况。通过CCK-8检测细胞增殖情况;并分析葡萄糖和乳酸的代谢情况;14d后扫描电镜观察细胞在支架内的生长情况;流式细胞仪检测干细胞相关表面标记表达;RT-PCR检测干细胞相关转录因子的表达;并检测扩增后的干细胞的多向分化潜能。结果表明:在动态微环境中扩增14d后,与静态条件下相比,支架内的细胞具有更强的增殖活性和更好的多向分化潜能。所扩增的细胞能够保持原有干细胞的特性。结论:所设计的支架-转瓶培养系统是一个简便有效的扩增脂肪干细胞的方法。

摘要：设计了一种细胞间距可调的trans well共培养方法，以研究脐带血来源的造血干／祖细胞（HS／PCs）和人脂肪干细胞（human-adipose derived stem cells，h-ADSCs）体外共培养时细胞间作用距离对造血干细胞扩增能力和脂肪干细胞在共培养后干细胞特性的影响。采用不同规格的砂纸打磨孔板的上壁面，经高精度游标卡尺测量，使两种细胞之间的有效接触间距为10--450μm不等。然后以h-ADSCs为基质细胞，分别考察HS／PCs和h-ADSCs在不同的作用距离下的共培养情况。其间每24小时对细胞进行计数，观察细胞形态。培养7天后对MNCs表面抗原CD34＋、CFU-GM集落扩增倍数进行了检测；同时也对***表面抗原（CD13、CD29、CD34、CD44、CIM5、CD73、CD105、CD166、HLA-DR）及其多向分化潜能（成骨、成软骨、成脂肪）进行分析以鉴定其干细胞性能。结果表明，通过transwell共培养，细胞之间在作用距离为350gm时HS／PCs的扩增效果最好，其中造血MNCs扩增了15．1±0．2倍，CD34＋扩增了5．0±0．1倍：扩增的h-ADSCs表达CD29、CD44、CD166，而不表达CD34、CD45，且在适当诱导条件下可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化。

摘要：背景:关于骨髓单个核细胞促使梗死心肌再生存在很大争议,早期研究均认为非常有效,甚至可以分化为心肌细胞,但最近的文献却基本否认了这种说法,认为单个核细胞仅可以有限的促进血管生成。目的:比较体外培养的脂肪干细胞和骨髓单个核细胞自体移植后对促进心肌细胞再生、血管新生及心肌梗死后心功能改善之间的差别。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2004-01/2005-09在解放军总医院心内科实验室与沈阳军区总医院实验室完成。材料:清洁级4月龄雄性新西兰白兔55只,10只用于骨髓单个核细胞标记追踪,剩余兔随机分为脂肪干细胞组、骨髓单个核细胞组、空白对照组,15只/组。方法:各组兔均结扎冠状动脉前降支制作心肌梗死模型,造模同时取少量腹部脂肪组织分离培养脂肪干细胞,抽取髂骨骨髓分离培养骨髓单个核细胞,用于自体移植。3周后再次开胸,脂肪干细胞组、骨髓单个核细胞组分别于梗死心肌直接注射自体脂肪干细胞和骨髓单个核细胞,空白对照组注射磷酸盐缓冲液。继续培养5周,将专用于骨髓单个核细胞标记追踪的10只兔行DAPI和BrdU标记,脂肪干细胞组的移植细胞行BrdU标记。主要观察指标:移植细胞标记情况。移植后心功能变化。苏木精-伊红染色和免疫组织化学检测结果。结果:脂肪干细胞组心肌梗死区可见大量移植细胞存在,可分化为心肌细胞、内皮细胞、参与新血管形成;骨髓单个核细胞组DAPI及BrdU标记后均未于梗死心肌组织发现单个核细胞存在。细胞移植前3组动物心功能基本相似;细胞移植后5周与空白对照组比较,脂肪干细胞组超声心动图及左心室压力曲线检测均显示心功能显著改善(P<0.05),骨髓单个核细胞组仅等容收缩期左心室压力最大上升速率明显改善(P<0.05)。脂肪干细胞组、骨髓单个核细胞组的血管密度均大于空白对照组(P<0.01,P<0.05),但前者于心肌梗死中心和边缘均可见大量血管,而后者仅在梗死区边缘血管密度增高。结论:脂肪干细胞移植可以促进心肌再生和新血管形成,进而改善心功能;而骨髓单个核细胞移植仅能促进血管新生,对心功能改善效果有限。

摘要：背景:有研究发现关节软骨微环境可诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。目的:验证软骨细胞能否诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化,以便成为组织工程构建关节软骨可能的新方法。设计、时间及地点:随机对照细胞实验,于2007-09/2008-07在南京大学生物医药生物技术国家重点实验室完成。材料:清洁级成年新西兰大白兔,雌雄不限,体质量1.5～2.0kg。方法:分离培养原代新西兰大白兔脂肪干细胞和软骨细胞,分别种植于6孔板和插入式细胞培养皿共培养2周后,胰酶消化终止。脂肪干细胞分别行油红O染色、碱性磷酸酶检测和甲苯胺蓝染色法鉴定。主要观察指标:倒置显微镜观察共培养前后脂肪干细胞的形态变化。甲苯胺蓝染色法检测共培养后脂肪干细胞的蛋白多糖的表达水平。免疫细胞化学检测共培养后脂肪干细胞的Ⅱ型胶原的表达水平。反转录-聚合酶链反应检测蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录水平。结果:脂肪干细胞分别经油红O染色、碱性磷酸酶染色和甲苯胺蓝染色法鉴定证实,分离的细胞具有多向分化能力,是脂肪来源的间充质干细胞。共培养1周后部分脂肪干细胞变圆,2周时其蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录和蛋白表达均增高。结论:与软骨细胞共培养后,脂肪干细胞可以被诱导成软骨样细胞。

摘要：目的构建基于脂肪于细胞、Ⅰ型胶原凝胶以及聚乳酸聚乙醇酸-β-磷酸三钙支架（PLGA-β-TCP）的骨组织工程复合体并对其异位成骨进行研究。方法设计构建脂肪干细胞-Ⅰ型胶原凝胶／PLGA—β—TCP复合体（A组），同时设立单纯细胞／PLGA—β—TCP材料复合体（B组）、单纯Ⅰ型胶原凝胶／PLGA-β-TCP复合体（C组）以及单纯PLGA-β-TCP支架材料（D组）作为对照。扫描电镜、相差显微镜观察细胞材料复合情况并对脂肪干细胞增殖以及成骨分化进行分析。体外成骨诱导培养2周后移植于自体股部肌袋，8周后取出，依次行放射学、组织学定性及半定量分析。结果（1）体外成骨诱导2周，A组细胞增殖率慢于B组（P〈0．05，n=4），但其细胞总数远高于后者（P〈0．01，n=4）。A组碱性磷酸酶（ALPase）活性、细胞外基质矿化程度均显著高于B组（P〈0．01，n=4）。A组细胞悬浮于Ⅰ型胶原凝胶并均匀分布于材料孔隙中而B组细胞仅见黏附于材料表面。（2）移植8周，X线片示A组高密度钙化影形成，B、C、D组未见有阳性结果。A组材料孔隙中均匀充满新生骨组织，可观察到骨小梁样结构。B组仅在少数孔隙中有类骨组织形成，同时伴有结缔组织长入。A组新生骨面积百分比显著高于B组（P〈0．01，n=4）。结论通过应用Ⅰ型胶原凝胶来实现脂肪干细胞与PLGA-β-TCP多孔支架材料的均匀复合，能够有效促进脂肪干细胞在材料孔隙中的成骨分化及均质骨组织形成。

摘要：目的设计一套用于心肌组织工程的双相脉冲电刺激(BPES)系统,并研究BPES对体外培养的脂肪干细胞(ADSC)向心肌细胞样细胞分化的影响。方法分离和培养SD大鼠ADSC,通过流式细胞术对细胞表型进行鉴定,通过成脂、成骨分化证明其多向分化潜能。选择第3代细胞随机分为2组:BPES组接种24 h后,给予BPES(脉宽2 ms、幅度2 V、频率2 Hz、刺激时间2 h/d,连续刺激3、7、14 d),每3 d换1次液;对照组培养条件与BPES组相同,但不给予BPES。通过倒置相差显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测细胞增殖,免疫荧光技术检测细胞同源盒蛋白Nkx-2.5和连接子蛋白43(CX43)的水平。结果流式细胞术证明分离的细胞是ADSC,成脂诱导后并用油红O染色,可见细胞内脂滴被染成红色,成骨诱导后碱性磷酸酶(ALP)和Von Kossa染色,可见钙结节特征;细胞增殖无明显变化,BPES组Nkx-2.5和CX43蛋白表达量明显高于对照组。结论成功设计了可用于组织工程的BPES系统,并证明BPES可在体外促进ADSC向心肌细胞样细胞分化。

摘要：目的:分析自体浓缩生长因子(concentrated growth factor,CGF)对比格犬脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外增殖及成骨向分化的影响。方法:取健康比格犬脂肪组织进行分离、培养ADSCs并鉴定其多向分化潜能,细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖。将ADSCs分为CGF组及对照组,对两组细胞进行成骨诱导后分别检测其碱性磷酸酶(ALP)活性,RT-PCR法检测I型胶原(Col-I),Runx2等成骨相关基因表达。结果:CGF组细胞增殖能力明显高于对照组(P<0.05);经成骨诱导的ADSCs在CGF作用下ALP活性明显增强(P<0.05),Col-I,Runx2等成骨相关基因的表达亦明显高于对照组(P<0.05)。结论:CGF能够促进ADSCs体外增殖和成骨向分化。

摘要：目的 探索人脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）对兔任意型皮瓣成活能力的影响.方法 获得健康成人的脂肪,经体外分离、培养及传代至第5代,进行流式细胞术检测和三系分化能力的鉴定.于大白兔背部对称地设计2个蒂部在头侧的任意型皮瓣（长6 cm、宽2 cm）,左、右侧分别为对照组和实验组.应用DiO荧光标记ADSCs,实验组（n=10）分5点注射2×106悬浮于0.5 ml无血清的DMEM培养基中的ADSCs,对照组（n=10）同样分5点注入无血清的DMEM0.5 ml,于术后7 d分别测量皮瓣成活面积;随机作冰冻切片,在激光扫描共聚焦显微镜下观察切片荧光显影情况;随机作常规切片HE染色,光镜下观察皮瓣组织毛细血管分布密度.统计学分析ADSCs在促进任意型皮瓣成活过程中的作用.结果 与对照组相比,实验组皮瓣成活率明显提高（P〈0.01）,组织学检测证明实验组毛细血管增生明显增多.结论 人ADSCs具有较好的免疫相容性,局部应用可明显提高皮瓣的成活率.