摘要：背景:通过制备肝素化胶原/壳聚糖支架来提高与转化生长因子β1的结合率,将脂肪干细胞种植于该支架材料上后直接种植于体内,可避免体外诱导过程,缩短组织工程构建的时间。目的:探索结合有转化生长因子β1的肝素化胶原/壳聚糖支架与脂肪干细胞复合修复兔软骨缺损的可行性。设计、时间及地点:软骨组织工程体外和体内实验相结合的研究,于2007-09/2008-07在南京大学生命科学院和解放军南京军区南京总医院动物试验中心完成。材料:分离培养兔脂肪间充质干细胞,行体外扩增培养至第3代,达到一定数量后接种于结合有转化生长因子β1的肝素化胶原/壳聚糖支架上得到细胞支架复合物。方法:取30只新西兰大白兔制备兔膝全层软骨缺损模型。随机选取一侧植入细胞支架复合物(实验组),其中15只另一侧植入结合有转化生长因子β1的肝素化胶原/壳聚糖支架(单纯支架组),余15只另一侧不做任何处理,作为空白对照。主要观察指标:于12周取材,从大体和组织学方面观察软骨修复情况。结果:实验组缺损区大部分被修复,缺损区被软骨组织充填,组织学检查提示形成典型的透明样软骨结构。而单纯支架组多不完全充填,其本为纤维组织状物覆盖,组织学检查未见明显软骨修复。空白对照组无明显修复。结论:结合有转化生长因子β1的肝素化胶原/壳聚糖支架与脂肪干细胞复合能较好修复软骨缺损。

摘要：背景:髓核组织工程被认为是椎间盘退变修复的理想方法,种子细胞是髓核组织工程的关键因素,但髓核细胞来源有限。目的:探讨兔脂肪干细胞在体外三维支架诱导培养条件下能否向髓核样细胞分化。设计、时间及地点:细胞-支架学体外观察,于2008-07/12在解放军北京军区总医院全军骨科研究所完成。材料:清洁级3月龄日本大耳兔3只,由北京实验动物技术有限公司提供。医用级壳聚糖为浙江金壳生物化学公司产品。方法:无菌条件下切取兔皮下脂肪组织,胶原酶消化法分离培养兔脂肪干细胞。取传至第2代细胞制成细胞悬液50μL(5×106个细胞),与150μL壳聚糖-藻酸盐复合物混合,置入12孔板,室温下20min左右形成凝胶状。设立3组,对照组仅添加含体积分数为10%胎牛血清的DMEM高糖培养液2mL;低氧诱导组、正常氧气诱导组均加入含牛血清白蛋白、转化生长因子β1、地塞米松、维生素C、BMP-7、1%ITS-plus、体积分数为10%胎牛血清的DMEM液,然后分别通气体积分数为2%的O2和20%的O2。各组置入37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中培养21d。主要观察指标:组织形态学观察,蛋白多糖水平,Ⅱ型胶原水平。结果:扫描电镜显示细胞在支架内正常黏附,细胞绒毛清晰可见,生长状态良好,番红O染色与阿利辛蓝染色均呈阳性,产生较多的蛋白多糖。随时间延长,对照组脂肪干细胞产生的蛋白多糖、Ⅱ型胶原水平均无明显变化;低氧诱导组、正常氧气诱导组脂肪干细胞产生的蛋白多糖、Ⅱ型胶原水平均显著增加,与对照组比较差异有显著性意义(P<0.001,P<0.05);且低氧诱导组产生蛋白多糖、Ⅱ型胶原水平均多于正常氧气诱导组(P<0.05,P<0.01)。结论:在适当的诱导条件下,兔脂肪干细胞在壳聚糖-藻酸盐凝胶支架中可以向髓核样细胞分化,产生与髓核组织相同的细胞外基质,且低氧状态下诱导效果较好。

摘要：背景:已证实降钙素基因相关肽可促进成骨细胞的增殖与分化,并加速骨折的愈合、促进异位骨化的形成,但其是否具有促使脂肪干细胞向成骨细胞定向分化的作用作者未查到相关报道。目的:探讨降钙素基因相关肽在体外定向诱导脂肪干细胞向成骨细胞增殖分化的可行性。设计、时间及地点:细胞学体外观察,基因及蛋白质学检测,于2006-10/2007-08在武汉大学医学院中心实验室和三峡大学医学院病理实验室完成。材料:清洁级4月龄健康新西兰大耳白兔2只。方法:密度梯度离心+贴壁法体外分离培养兔脂肪干细胞,传至第3代分为2组:对照组加入含10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50mg/L抗坏血酸、1×10-8mol/L地塞米松、体积分数为0.15的胎牛血清的RPMI1640骨诱导培养基,实验组在此基础上加入1μg/L降钙素基因相关肽进行诱导培养。主要观察指标:细胞形态学变化,免疫组织化学染色测定细胞碱性磷酸酶活性,四环素标记法检测矿化结节的形成,RT-PCR和Westernblot法检测成骨细胞标志性蛋白I型胶原、骨钙素的表达。结果:实验组脂肪干细胞经成骨诱导培养后,形态规则、多角型细胞增多,细胞倍增时间明显短于对照组。随诱导时间的延长,实验组细胞碱性磷酸酶活性呈增加趋势,诱导7,10,14d细胞碱性磷酸酶活性均显著高于对照组(t=13.26,P<0.01)。诱导21d与对照组比较,实验组形成的金黄色圆形矿化结节数量增多,结节增大。诱导7d,14d实验组I型胶原及骨钙素mRNA、蛋白水平的表达均强于对照组。结论:在体外降钙素基因相关肽能诱导并促进兔脂肪干细胞向成骨细胞方向分化。

摘要：背景:绿色荧光蛋白作为细胞示踪标记已得到广泛应用,作者所查尚未见到以增强型绿色荧光蛋白作为标记方法用于研究脂肪干细胞与膀胱脱细胞基质复合后体外生长特性的报道。目的:利用绿色荧光蛋白标记兔来源的脂肪干细胞,观察其作为种子细胞复合膀胱脱细胞基质体外培养的生长特性,为复合物回植体内时间提供参考。设计、时间及地点:细胞标记示踪实验,于2009-01/05在上海组织工程研究与开发中心及上海第六人民医院实验动物房完成。材料:取2只新西兰大白兔,制备膀胱脱细胞基质。取2只新西兰大白兔脂肪分离脂肪干细胞。方法:体外培养增殖后脂肪干细胞转染增强型的绿色荧光蛋白,转染前后根据增殖速度,绘制生长曲线。然后将增强型绿色荧光蛋白转染的第3代脂肪干细胞以30×106的浓度接种于1cm×1cm大小的膀胱脱细胞基质支架材料上培养。主要观察指标:观察细胞转染后的生长特性,检测复合后的细胞总数,荧光显微镜观察复合后细胞形态。结果:脂肪干细胞经转染后生长增殖速度未受明显影响。细胞DNA检测示复合培养7d细胞增殖状态最佳。荧光显微镜观察显示培养7d细胞增殖良好,10d后呈现老化形态。结论:增强型的绿色荧光蛋白转染不影响脂肪干细胞传代、增殖。脂肪干细胞-膀胱脱细胞基质复合物体外培养7d左右回植较合适。

摘要：背景:软骨基质主要为Ⅱ型胶原和葡萄糖胺聚糖,它是软骨细胞分化和发育的先天环境,能促进干细胞向软骨细胞分化。目的:观察兔软骨基质支架与同种异体脂肪干细胞在体外的生物相容性。设计、时间及地点:观察实验,于2007-12/2008-05在遵义医学院珠海校区中心实验室完成。材料:取兔新鲜耳郭软骨组织在蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟的保护下利用低渗透压和TritonX-100脱去细胞成分制备软骨基质。脂肪干细胞由新西兰大白兔颈部脂肪组织经剪碎、Ⅰ型胶原酶消化并离心后获得。方法:将2×l07L-1的脂肪干细胞悬液0.2mL滴在软骨基质支架表面,置于37℃、体积分数为0.05CO2饱和湿度的培养箱中静置4h后加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液培养。主要观察指标:采用倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞在支架上的黏附、生长及增殖情况,同时计算细胞黏附率,并采用二甲氧唑黄比色法检测细胞增殖趋势。结果:扫描电镜和倒置显微镜观察到脂肪干细胞在软骨基质支架上黏附和变形,其黏附率为93.7%;苏木精-伊红染色见细胞向支架深层生长;二甲氧唑黄比色法测定细胞生长曲线表明细胞在支架上有增殖的趋势。结论:兔软骨脱细胞基质与同种异体脂肪干细胞在体外具有良好的生物相容性。

摘要：背景:脂肪组织工程研究中,寻找一种优良的生物支架材料作为脂肪干细胞的载体极为重要。目的:评价兔脂肪干细胞与海绵状Ⅰ型胶原蛋白的生物相容性。设计、时间及地点:细胞-支架学体外观察,于2007-01/03在南方医科大学组织工程研究中心完成。材料:三四月龄雌性新西兰大白兔8只,由南方医科大学实验动物中心提供。海绵状Ⅰ型胶原蛋白为广州创尔公司产品。方法:兔麻醉后取颈部皮下脂肪,体外分离培养脂肪干细胞,选取生长良好的第3代细胞,调整密度为1×109L-1细胞悬液。将无菌的Ⅰ型胶原蛋白海绵裁成10mm×10mm×5mm放入96孔板内,培养液平衡后,每孔支架材料表面接种0.1mL细胞悬液,加入含胎牛血清的DMEM培养液。主要观察指标:脂肪干细胞的形态及表面标志表达,细胞在支架材料上的黏附、增殖情况,光镜及电镜下观察细胞-支架复合物。结果:原代培养的脂肪干细胞形态主要呈宽大扁平短梭形,传代后细胞形态以长梭形为主,第3代脂肪干细胞CD29,CD44免疫荧光染色均呈阳性。细胞与支架混合培养后平均黏附率为92.38%,并保持正常的生长增殖速度。光镜下随培养时间延长,支架上的细胞逐渐增多,极少从支架材料上掉落,DiI荧光染色后可见细胞膜发出红色荧光。电镜下部分细胞呈团簇状生长,聚集性分布,黏附于胶原海绵表面或孔隙内,细胞周围有大量的基质。结论:海绵状Ⅰ型胶原蛋白与兔脂肪干细胞具有良好的体外生物相容性,能够为组织工程种子细胞的生长提供适宜的三维空间,可作为脂肪组织工程种子细胞的载体材料。

摘要：背景:不同浓度的地塞米松在体外诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化过程中所起的作用是不同的,其作用机制尚不明确。目的:验证脂肪干细胞向成骨细胞分化的能力,观察成骨细胞分化早期不同浓度地塞米松对脂肪干细胞体外增殖的抑制效果。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/03在南方医科大学组织工程研究中心完成。材料:5周龄雄性SD大鼠10只,由南方医科大学实验动物中心提供。地塞米松为Sigma公司产品。方法:切取大鼠腹股沟皮下脂肪组织,用酶消化法分离培养脂肪干细胞,传至第3代后,加入条件培养液(含胎牛血清、维生素C、β-甘油磷酸钠、青霉素、链霉素的DMEM高糖完全培养基)进行体外预培养。设立2组:地塞米松组分别于细胞传代后第0,2,4天向培养基中加入10-6mol/L地塞米松1mL,空白对照组仅加入等量条件培养液。主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞生长及成骨分化情况。采用MTT比色法检测细胞增殖情况。结果:①原代培养中贴壁细胞多数呈长梭形,少数呈小圆形或三角形,六七天后进行传代;传代后细胞生长速度较原代细胞明显增快,至第15代细胞仍未出现明显衰老现象;第3代细胞在加入地塞米松后逐渐呈均一的长梭形,随时间延长呈叠形多层排列,细胞外基质明显增多,并逐渐形成多个小结样结构。空白对照组细胞形态不一,部分细胞呈多边形或三角形,细胞外基质明显少于地塞米松组,罕见小结样结构。②在体外传代培养过程中,空白对照组脂肪干细胞能够保持持续分裂增殖的能力。与空白对照组比较,细胞传代培养后0,2d加入地塞米松,干预6,8,10,12d时细胞数量均明显下降(P0.05)。结论:传代的脂肪干细胞经地塞米松处理后,细胞形态趋于成熟,生长速度减慢,可定向分化为成骨细胞。在向成骨细胞分化早期,地塞米松能够抑制脂肪干细胞的体外增殖。

摘要：目的采用Ⅰ型胶原凝胶悬浮包埋兔脂肪干细胞并复合PLGA-β-TCP支架修复自体桡骨缺损。方法使用Ⅰ型胶原凝胶悬浮兔脂肪干细胞并与PLGA-β-TCP复合构建脂肪干细胞一Ⅰ型胶原凝胶／PLGA-β-TCP复合体（ASCs—COL／PLGA-β-TCP）（A组），同时设立单纯细胞／PLGA-β-TCP材料复合体（ASCs／PLGA-β-TCP）（B组）、单纯Ⅰ型胶原凝胶／PLGA-β-TCP复合体（COIMPLGA-β-TCP）（C组）、单纯PLGA-β-TCP支架材料（D组）以及空白缺损（E组）作为对照，体外成骨诱导培养2周后植入桡骨1．5cm缺损部位。30只兔（60侧）采用两因素随机区组设计每只兔两侧骨缺损植入组别。分别于术后8、16、24周处死兔，取材，进行相关分析。结果术后8周，大体观察、放射学、组织学检测示A组桡骨断端连续性基本恢复。术后16周，A组骨断端连续性完全恢复，髓腔未通。术后24周，A组髓腔再通，改建塑形趋于完成，材料基本降解。自术后16～24周，A组残存材料比例低于其他3组（P〈0．05，n=4）；与A组比较，在整个观察周期内，B、C、D组均无明显成骨现象，E组保持骨缺损状态（P〈0．05，n=4）。结论通过应用Ⅰ型胶原凝胶悬浮包埋脂肪于细胞进而与PLGA-β-TCP多孔支架材料复合构建新型仿生骨组织工程复合体，可修复兔桡骨1．5cm缺损。

摘要：背景:现有国内外文献报道的脂肪干细胞分离、培养方法并不完全一致,所应用的消化酶、消化方法、培养基等均存在差异。目的:观察体外分离培养的兔脂肪干细胞生物学特性。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-04/2008-03在昆明医学院生物医学中心干细胞所完成。材料:健康成年新西兰大白兔6只,由昆明医学院实验动物中心提供。Ⅰ型胶原酶为美国Gibco公司产品,胰蛋白酶为美国Sigma公司产品。方法:无菌切取兔腹股沟皮下脂肪垫,采用Ⅰ型胶原酶搅拌消化法分离培养原代脂肪干细胞,待细胞生长至80%融合时传代。主要观察指标:倒置显微镜和苏木精-伊红染色观察细胞形态及生长情况,免疫荧光细胞化学染色检测细胞表面抗原的表达,MTT比色法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞增殖指数。结果:自兔皮下脂肪分离培养获得的脂肪干细胞增殖迅速,低密度生长时呈三角形或短梭形,核/浆比例较大,接近融合时呈成纤维细胞样外观,长期传代形态无明显改变。第3代脂肪干细胞表面抗原CD44呈阳性表达,CD34为阴性;细胞生长曲线呈"S"形,在对数生长期其细胞倍增时间为59h。随传代次数的增加,来自同一供体的兔源性脂肪干细胞增殖指数逐渐升高,至第8代达到最高,以后逐渐降低。结论:兔皮下脂肪组织中含有丰富的间充质干细胞,兔源性脂肪干细胞体外以成纤维细胞样形态贴壁生长,表达CD44表面标志物,具有较强的体外增殖能力。

摘要：背景:脂肪干细胞是从脂肪组织中分离提取的一种具有多向分化潜能的干细胞,对缺血性疾病的治疗有积极作用。目的:观察局部移植人来源脂肪干细胞对小鼠随意型皮瓣成活能力及血管新生效应的影响。方法:体外经分离、培养及传代健康成人脂肪干细胞。于SPF小鼠背部设计蒂在头侧的随意型皮瓣设为实验组,随后于皮瓣蒂部、中部、远端分3次注射脂肪干细胞悬液、并设置以同法注射等量PBS的小鼠作对照组。移植后7 d,计算各组皮瓣成活率。移植后14 d,取皮瓣组织,随机作冰冻切片CD31免疫荧光染色,荧光显微镜下观察皮瓣组织微血管分布情况,并对CM-Dil标记的脂肪干细胞示踪;ELISA法检测皮瓣组织中血管内皮生长因子水平;Western blot法检测皮瓣组织中基质细胞衍生因子1蛋白的表达。结果与结论:与对照组相比,实验组小鼠背部随意皮瓣成活率明显提高,皮瓣组织中微血管数目明显增多,血管内皮生长因子分泌水平明显升高,基质细胞衍生因子1蛋白表达明显增多(P<0.05)。结果证实,人脂肪干细胞局部移植到随意型皮瓣后,可上调血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1的表达,促进皮瓣的血管新生。