摘要：背景:为避免骨髓间充质干细胞培养过程中应用异种血清的排斥以及提高骨髓间充质干细胞培养效率,制备脐带血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞是目前的研究热点。目的:比较脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性。设计、时间及地点:开放性实验,于2006-10/2008-06在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成。材料:16份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供。方法:采用FicollPaque细胞分离液从16例新鲜成人骨髓穿刺液中分离骨髓间充质干细胞,分别用含体积分数为10%脐带血清、成人自体血清的DMEM/F12培养基培养,取第4代细胞进行实验。流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系分别诱导各组骨髓间充质干细胞定向分化,通过细胞形态观察、免疫表型及免疫化学染色进行鉴定。主要观察指标:①细胞形态。②骨髓间充质干细胞计数和细胞周期。③表面标志物的鉴定。④免疫组织化学染色观察骨髓间充质干细胞诱导成骨、成脂情况。结果:①脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞在增殖数量和速度上优于成人自体血清组(P<0.05)。两种血清培养条件下,只有少数细胞处于活跃的增殖期,脐带血清组S期细胞多于成人自体血清组(P<0.05)。②脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞表达CD29、CD73、CD105的阳性率均在90%以上,高于成人自体血清组(P<0.05);而CD31、CD34、CD45的阳性率均在2%以下,CD31阳性率低于成人自体血清组(P<0.05)。③脐带血清培养的骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞阳性率和脂肪细胞阳性率均高于自体血清组(P<0.05)。结论:脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞的纯度和体外诱导分化能力比成人自体血清组高,更适合临床应用。

摘要：背景：骨髓内的间充质干细胞含量极少，因此课题立项设计之一即如伺得到足够数量的骨髓间充质干细胞，并避免细胞培养过程中因动物血清造成的病原体污染和异种血清所致的过敏反应。目的：拟建立脐带血血清培养系统，以实现体外扩增人骨髓间充质干细胞的目标。设计、时间及地点：开放性实验，于2006-09／2007-10在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成。材料：12份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供，6例采自正常供者，6例采自拟行造血干细胞移植的肿瘤患者。方法：无菌条件下抽取未抗凝的脐带血，静置待血凝块完全析出后吸取血清，离心弃沉淀，取各项病原微生物检测均呈阴性的脐带血血清用于细胞培养，临用前56℃水浴灭活30min。抽取正常供者和肿瘤患者的骨髓液100mL／份，采用Ficoll Paque分离液分离骨髓单个核细胞，加入含体积分数为0．1脐带血血清的DMEM／F12进行传代培养。传至第3代低温、液氮冻存，4-8周后予以解冻复苏，胰蛋白酶消化传代。取第4代骨髓间充质干细胞，锥虫蓝染色后，N／k成骨诱导体系培养14d，碱性磷酸酶染色；加入脂肪诱导体系培养14d，油红O染色。主要观察指标：绘制细胞生长曲线，流式细胞仪测定细胞周期及表面抗原的表达，骨髓间充质干细胞定向分化情况。结果：骨髓间充质干细胞扩增培养至第4代，接种后两三天为生长潜伏期，3-5d为对数增殖期，5-7d细胞生长缓慢进入平台期。采自正常供者和肿瘤患者的骨髓间充质干细胞，冻存前后扩增数量均基本相似（P〉0．05），细胞存活率均〉96％，CD29、CD73、CD105阳性率均〉90％，CD31、CD34、CD45阳性率均〈5％，诱导2周后成骨细胞和脂肪细胞的阳性率均〉85％。结论：应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人骨髓间充质干细胞，且冻存前后骨髓间充质干细胞生物学特性没有明显改变。