摘要：背景：目前神经干细胞的定向分化是神经干细胞研究的热点。脑源性神经生长因子作为诱导剂可否诱导神经干细胞分化为神经元。目的：观察在表皮生长因子培养条件下,不同质量浓度脑源性神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的影响。设计：对比实验。单位：中国医科大学人体解剖学教研室。材料：实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成。提取成年SD大鼠海马神经干细胞,无血清技术培养。清洁级成年SD大鼠3只,体质量200-250g,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。实验过程中应用的表皮生长因子、脑源性神经生长因子均由R＆D公司提供。方法：①无菌条件下分离大鼠海马组织,用含碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养神经干细胞。②取第4代神经干细胞,利用有限稀释法进行单细胞克隆培养。将单细胞克隆传代后的克隆球细胞进行神经干细胞的鉴定。克隆球细胞行巢蛋白免疫细胞化学染色,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色。③单细胞克隆的神经干细胞脑源性神经生长因子诱导分化实验,根据脑源性神经生长因子质量浓度不同分成0μg/L浓度的对照组和50、100、150、200μg/L浓度的4个实验组,各组的培养液中均加入表皮生长因子,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色,检测神经干细胞向神经元分化情况。主要观察指标：神经干细胞分化为神经元的比例。结果：①神经干细胞免疫细胞化学染色结果显示,单细胞克隆培养后克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②50,100μg/L组脑源性神经生长因子组神经干细胞分化为神经元比例明显高于对照组、150,200μg/L脑源性神经生长因子组组（t=2.502-5.025,P〈0.05）;50,100μg/L脑源性神经生长因子组之间神经干细胞分化为神经元的比例差异不显著（P〉0.05）;对照组、150,200μg/L组3组间神经干细胞分化为神经元比例差异不显著（P〉0.05）结论：在20μg/L表皮生长因子培养条件下,脑源性神经生长因子促使神经干细胞向神经元分化的较佳质量浓度为50μg/L。

摘要：目的筛选有效抑制小胶质细胞上脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)序列,并观察其对小胶质细胞活性标记物OX-42表达的调节作用。方法设计并合成针对BDNF的siRNA3对(siRNA1588,siRNA283,siR-NA232)及一条带绿色荧光标记的通用阴性对照FAM-siRNA。在LipofectamineTM 2000介导下转染小胶质细胞。分别采用Real-TimePCR及Western blot方法测定并比较其抑制率;采用磺基罗丹明B法(sulforhodamine B,SRB)分析转染复合物的细胞毒性。同时采用免疫荧光组织化学结合共聚焦显微镜观察BDNF和OX-42的表达情况。结果①与阴性对照组及siRNA283、siRNA232相比,BDNFsiRNA1588(50μmol·L-1,脂质体与siRNA比例1∶3)干扰小胶质细胞后,其mR-NA和蛋白的相对表达量最低(P<0.01)。②Lipofectami-neTM 20008μl复合50μmol·L-1siRNA(脂质体与siRNA比例为1∶3),不仅细胞毒性低而且转染效率高(P<0.01),为最佳转染条件。③BNDF和OX-42存在共表达;且siR-NA1588作用后OX-42的平均光密度值(IOD/area)明显降低(P<0.01)。结论①siRNA1588对小胶质细胞上BDNF表达的抑制效果最大。②BDNF在小胶质细胞的活性调节中具有重要作用。

摘要：目的以高表达脑源性神经营养因子（BDNF）的宫颈癌细胞系HeLa细胞为模型，筛选针对BDNF基因的有效干扰RNA序列，并观察BDNF基因沉默对HeLa细胞增殖和凋亡的影响。方法设计和构建两个针对人BDNF基因的siRNA真核表达载体，经酶切鉴定和DNA序列分析鉴定后用脂质体Lipofectamine 2000介导转染，将空载体质粒pGenesil-1和两个重组质粒pGenesil—shRNA—BDNF1、pGenesil—shRNA—BDN心分别转染人人HeLa细胞（依次命名为P0、P1和R组）；采用RT—PCR和Western blot法分别从mRNA水平和蛋白水平检测BDNF表达的变化；四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞的增殖水平；流式细胞仪和Hoechest33258染色检测细胞凋亡。结果成功构建了针对BDNF的siRNA真核表达载体。P1组与未转染、P0、P2组相比，BDNFmRNA表达水平（F=48．19，P〈0．01）和BDNF蛋白表达水平（F=13．74，P〈0．01）均明显降低，P2组则未达实验预期的干扰目的（P〉0．05）。通过MTr实验，发现P．组细胞生长速度明显减慢，增殖高峰后移；流式细胞术检测证实早期凋亡率P1组[（53．4±4．2）％]明显高于未转染组[（0．8±0．4）％]、P。组[（5．1±1．8）％]和P2组[（7．9±2．4）％；F=269．77，P〈0．01]。结论BDNF基因高表达于宫颈癌细胞系HeLa细胞，BDNF基因沉默能明显增加HeLa细胞的凋亡并抑制其增殖，提示BDNF基因可能成为恶性肿瘤治疗的新靶点。

摘要：背景:移植神经干细胞的分化受移植部位微环境、各种生长及细胞因子的影响。目的:实验拟观察神经干细胞移植与脑源性神经营养因子联合应用对老年性痴呆鼠行为学恢复及海马线粒体膜的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-09/2007-09在重庆医科大学动物实验室及细胞实验室完成。材料:神经干细胞来源于新生1d龄SD大鼠。Y迷宫筛选对电击敏感并逃避迅速的三四月龄健康雄性SD大鼠,随机分成4组:正常对照组、神经干细胞组、脑源性神经营养因子组、联合组移植,每组10只。方法:分离培养大鼠神经干细胞。参照包新民等的大鼠脑立体定位图谱制备老年性痴呆大鼠模型。造模后,神经干细胞组双侧海马区注射神经干细胞,脑源性神经营养因子组双侧海马区注射脑源性神经营养因子,联合移植组注射神经干细胞同时持续侧脑室注射脑源性神经营养因子。主要观察指标:用分子生物学检测老年性痴呆大鼠海马线粒体膜电位的变化,行Y迷宫试验观察大鼠行为学中学习记忆能力。结果:联合移植组老年性痴呆大鼠海马线粒体膜电位明显升高,并高于神经干细胞组、脑源性神经营养因子(P<0.05),与正常对照组比较无明显差异。脑源性神经营养因子组、神经干细胞组学习记忆能力虽有明显恢复,但与联合移植组和正常对照组比较还有一定的距离(P<0.05)。结论:神经干细胞与脑源性神经营养因子联合应用能能稳定海马线粒体功能,从而抑制神经细胞凋亡,能改善老年性痴呆鼠的学习记忆功能障碍。

摘要：目的观察脊髓压迫性损伤后脑源性神经生长因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表达变化与有髓神经纤维脱髓鞘病变之间的关系,以阐明BDNF对神经纤维脱髓鞘病变的作用。方法 SD雄性大鼠60只,将其均分成3组:模型组、假手术组和正常组,用自行设计的压迫器制作大鼠脊髓压迫模型。模型组作脊髓压迫24 h,假手术组仅作脊髓显露,不作压迫。锇酸和LFB(luxol fast blue)染色观察有髓神经纤维变化情况;Western blot检测髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)和BDNF的表达。结果 24 h后,与假手术组比较,模型组压迫前段(T11)有髓神经纤维无明显肿胀和数量变化,MBP表达未见变化(P>0.05),但BDNF的表达量升高(P<0.05);而压迫段(T12)和压迫后段(L1)有髓神经纤维肿胀并伴有数量降低(P<0.05),BDNF和MBP的表达量也随之下降(P<0.05),且压迫段(T12)脱髓鞘病变更为严重,BDNF降低也更为明显(P<0.01)。结论大鼠脊髓压迫性损伤BDNF表达减少可导致脊髓脱髓鞘病变的发生,而BDNF表达量升高可能对脊髓脱髓鞘病变具有保护作用。

摘要：目的探讨EphA4受体对大鼠海马脑区神经元脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)蛋白质和转录本表达的影响。方法将原代培养的大鼠海马脑区神经元随机分为正常对照组和EphA4-Fc组,EphA4-Fc组给予EphA4受体拮抗剂EphA4-Fc,培养7 d后,Western blot法检测大鼠海马脑区BDNF蛋白的表达,qPCR检测BDNF mRNA的表达。结果与正常对照组相比,EphA4-Fc组大鼠海马脑区神经元BDNF蛋白表达明显升高(P<0.01),mRNA转录本Ⅱc的表达明显升高(P<0.001)。结论给予EphA4-Fc后,大鼠海马脑区神经元BDNF蛋白翻译增加与mRNA转录本Ⅱc表达升高相关。本研究为临床上脑卒中的治疗以及神经元保护提供了新的思路。

摘要：目的观察脑源性神经生长因子(BDNF)对脊髓压迫性损伤(CSCI)后有髓神经纤维脱髓鞘病变的影响,为阐明BDNF对神经纤维脱髓鞘病变修复提供实验基础。方法将大鼠均分成4组:正常组、假手术组、压迫组和减压组。用自行设计的压迫器制作大鼠脊髓压迫模型。压迫组作脊髓压迫12 h,减压组作脊髓压迫1 h,假手术组仅作脊髓显露,不作压迫。用锇酸染色观察CSCI后1、3和7 d有髓神经纤维变化情况;Western blot和免疫荧光双标检测BDNF和髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达。结果压迫组和减压组都出现脱髓鞘病变,并随着时间的延长,髓鞘逐渐水肿、变性、MBP崩解。BDNF表达量在CSCI后随时间延长也逐渐降低(P<0.05),但与压迫组相比较,减压组脱髓鞘病变较轻且MBP和BDNF降低幅度小而缓慢(P<0.05)。结论 CSCI后尽早减压可减轻脱髓鞘的发生,且可能与BDNF的表达有关。