摘要：目的研究Par-4基因沉默对人骨髓间充质干细胞（hBMSC）中Smac基因表达和半胱氨酸蛋白水解酶（Caspase）3酶活性的影响及其抗凋亡作用。方法原代培养hBMSC。谷氨酸诱导hBMSC凋亡。设计和合成两对针对Par-4基因mRNA的小RNA干扰（siRNA）序列（Par-4-SiRNA-1、2），构建真核细胞表达载体，用脂质体介导转染hBMSC，利用G418筛选稳定表达细胞株。实时荧光定量PCR法检测Par-4 mRNA表达水平。流式细胞术测定细胞凋亡百分率。Western印迹测定Smac蛋白表达量。比色法测定Caspase-3酶的活性。结果设计的Par-4-SiRNA-1、2可显著诱导hBMSC中Par-4基因沉默，Par-4 mRNA水平分别被降低88％、67％，谷氨酸诱导hBMSC凋亡，凋亡百分率为（58．9±8．9）％。Par-4-SiRNA-1可显著拈抗谷氨酸的诱导凋亡作用，凋亡百分率降为（37．2±6．3）％（F=58．26，P〈0．01）。Par-4-SiRNA-1对谷氨酸诱导的hBMSC中Smac蛋白表达上凋（P〈0．01）和Caspase-3酶活性上调（P〈0．01）有显著的抑制作用（P〈0．01）。结论Par-4基因沉默能拈抗谷氨酸对hBMSC凋亡的诱导作用。其机制可能与Smac基因表达和Caspase-3酶活性被抑制有关。

摘要：目的观察膜孔相互作用分子1（Stiml）基因表达下调对肝细胞癌（HCC）细胞凋亡的作用。方法设计和合成Stiml基因干扰序列，构建慢病毒介导的RNA干扰载体，利用第3代慢病毒包装系统进行病毒制备；干扰慢病毒以2倍感染复数（MOI）感染SMMC7721细胞，定量聚合酶链反应（PCR）和免疫印迹法（WB）检测Stiml基因表达；采用碘化丙锭（PI）和膜联蛋白V（AnnexinV）双染法检测SMMC7721细胞的凋亡变化。结果测序结果表明干扰序列连入干扰载体；定量PCR和Westernblot法检测结果显示干扰慢病毒感染可以抑制Stiml基因75％以上的表达；流式细胞仪检测结果表明在Stiml基因被敲减后，凋亡细胞的比例从8％上升到26％。结论Stiml基因的敲减促进SMMC7721细胞的凋亡。

摘要：背景:隔药灸治疗溃疡性结肠炎具有良好的干预效果,是否与溃疡性结肠炎发病过程中中性粒细胞的凋亡有关?目的:观察溃疡性结肠炎大鼠中性粒细胞凋亡情况及隔药灸的调节作用。设计:动物实验观察。单位:上海市针灸经络研究所。材料:实验于2002-08/2003-06完成。选择雄性清洁级SD大鼠30只,体质量(140±20)g,由上海中医药大学实验动物中心提供。按随机数字表法分为两组,造模组20只,正常对照组10只。方法:采用免疫学方法建立大鼠溃疡性结肠炎模型。随机抽取模型大鼠4只与正常组大鼠2只剖取远端结肠作组织病理学观察,在确定模型制备成功后,将剩余模型大鼠分为模型组和隔药灸组,每组8只,8只正常大鼠作为对照组。隔药灸组在双天枢及气海穴施以隔药灸,药饼以附子、肉桂等配制,艾炷约90mg置于药饼上施灸,1次/d,共灸10次。治疗结束后3组大鼠同时处死,分离外周血单个核细胞进行培养,取以上各组按1∶50稀释的培养上清液,以等体积RPMI-1640培养液作为空白对照组。分别与正常大鼠外周血中性粒细胞共同孵育,应用流式细胞术检测中性粒细胞的凋亡率。主要观察指标:各组大鼠外周血中性粒细胞凋亡率比较。结果:纳入大鼠造模组20只,正常对照组10只。造模组4只大鼠与正常组2只大鼠处死作组织病理学观察,进入结果分析造模组和正常对照组分别为16和8只。①溃疡性结肠炎大鼠中性粒细胞凋亡率显著低于空白对照组[(16.34±2.80)%,(52.33±9.94)%,(q=-35.99,P0.05)。②经治疗后隔药灸组中性粒细胞凋亡率[(36.03±8.31)%]显著高于溃疡性结肠炎模型组(q=19.69,P<0.01),但仍低于正常对照组(q=-16.30,P<0.05)。结论:调节和/或减轻溃疡性结肠炎中性粒细胞凋亡被抑制的状态,可能是隔药灸治疗溃疡性结肠炎的主要机制之一。

摘要：目的观察靶向小干扰RNA（siRNA）对小鼠肺缺血／再灌注损伤（PIRI）时细胞凋亡及CCAAT／增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的影响。方法荧光标记法观察靶向siRNA在小鼠体内的分布并评估转染效率。C57BL／6J小鼠50只，随机分为5组（n=10）：假手术组（Sham组）、缺血／再灌注组（I／R组）、I／R＋载体组（I／R＋Vehicle组）、I／R＋阴性对照组（I／R＋Control—siRNA组）和IVR＋***组（I／R＋CHOP—siRNA组）。取左肺，检测肺湿／干重比（W／D）、总肺水含量（TLW）和肺泡损伤定量评估（]QA），光镜和电镜观察肺组织结构改变，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）、Westernblot检测CHOP、葡萄糖调节蛋白78（GR-VT8）mRNA和蛋白表达水平，原位末端转移酶标记（TUNEL）法检测细胞凋亡指数（AI）。结果靶向siRNA通过滴鼻法可有效分布于肺脏中。与Sham组比较，L／R组中CHOP、GRP78mRNA和蛋白表达水平（0．80±．03、0．80±0．02；0．80±0．04、0．84±0．02）均升高（P〈0．05），W／D（5．24±0．49）、TLW（4．24±0．49）、IQA[（42．80±4．21）％]和AI[（34．50±1．51）％]均明显增加（P〈0．01）；肺组织形态结构发生明显损伤；与I／R＋Vehicle组和L／R＋***组比较，I／R＋CHOP-siRNA组中GRP78mRNA和蛋白表达水平（0．84±0．04、0．85±0．04）无明显变化（P〉0．05），而CHOPmRNA和蛋白表达水平（0．40±0．03、0．44±0．04）均降低（P〈0．05），W／D（2．54±0．24）、TLW（1．54±0．24）、IQA[（16．71±2．33）％]和AI[（11．50±1．58）％]亦均降低（P〈0．01）；肺组织形态结构损伤减轻。结论靶向siRNA对I／R损伤肺具有良好的保护作用，其机制可能与其对抗过度的未折叠蛋白反应（UPR）中CHOP介导的细胞凋亡有关。

摘要：目的检测人前列腺癌细胞(PC-3M)中Omi／HtrA2的表达情况,并构建其小干扰 RNA(siRNA)表达载体,探讨Omi／HtrA2对PC-3M凋亡的影响。方法以细胞免疫组织化学和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Omi／HtrA2在前列腺癌细胞系(PC-3M)和正常前列腺细胞中的表达。利用软件辅助设计Omi／HtrA2特异性siRNA序列,体外合成后将其克隆入真核表达载体 psiRNA-hHlneo。以脂质体法转染psiRNA-Omi／HtrA2载体至PC-3M中,以RT-PCR和Western blot法检测psiRNA-Omi／HtrA2对Omi／HtrA2转录和表达的沉默效应。用噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞法检测siRNA导致Omi／HtrA2基因沉默后,PC-3M细胞凋亡的变化。结果细胞免疫组织化学和RT-PCR均显示Omi／HtrA2在PC-3M细胞中高表达。酶切和DNA测序证实合成的siR- NA基因序列正确,并已被准确克隆入psiRNA-hHlneo载体中。psiRNA-Omi／HtrA2载体可特异性抑制PC-3M细胞中Omi／HtrA2的表达。转染psiRNA-Omi／HtrA2载体的PC-3M细胞凋亡下调。结论促凋亡因子Omi／HtrA2可导致前列腺癌细胞凋亡,Omi／HtrA2的表达对前列腺癌的发展有重要作用。

摘要：目的　研究丙型肝炎病毒非结构蛋白 5A(HCVNS5A)对肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导HepG2细胞凋亡的抑制作用。方法　设计HCV 1bNS5A区基因片段的特异引物 ,以逆转录巢式PCR方法扩增NS5A基因片段 ,并将其进行TA克隆 ,对阳性克隆进行酶切与序列鉴定 ;构建NS5A基因表达载体 ;通过Lipofectamine基因转染法 ,将NS5A区基因导入HepG2细胞 ,加入TNFα培养 4 8h ;应用Westernblot检测caspase 3被切割、细胞色素C释放的情况以及通过AnnecxinV FITC染色两种方法 ,观察NS5A蛋白对TNFα诱导的HepG2细胞凋亡的抑制效应。结果　成功建立HCVNS5A蛋白真核表达转基因细胞模型 ,发现该蛋白对TNFα所诱导HepG2细胞凋亡有抑制作用。结论　HCVNS5A蛋白可以抑制TNFα诱导的HepG2细胞凋亡。

摘要：目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸（ASODN）对骨肉瘤细胞的抑制作用。方法设计合成VEGF ASODN，按不同浓度转染骨肉瘤OS-732细胞，设正义（SODN）和空白对照组进行比较。观察细胞生长状态，Western blot检测VEGF蛋白表达，MTT法测定细胞生长抑制率（IR），流式细胞仪检测细胞凋亡。结果与SODN、对照组比较，ASODN组细胞中VEGF表达显著降低（P〈0．05），IR（分别为10μmol／L组34．21％，20μmol／L组39．50％）显著增高（P〈0．05），上述效应呈浓度依赖性；镜下观察ASODN转染细胞代谢衰退，当转染浓度至20μmol／L时，其凋亡率AI值（18．25±0．40）％显著高于对照组（5．20±0．28）％和SODN组[（6．41±0．10）％，P〈0．01]。结论ASODN能够特异性封闭骨肉瘤细胞VEGF基因表达；并可抑制细胞增殖，诱导其凋亡。

摘要：目的观察微小RNA（miRNA，miR）-83a表达对体外骨髓间充质干细胞（BMSC）的诱导分化和生物学功能的影响。方法将实验分为3组：A组：PEF-miR-83a和PSV2neo共转染组；B组：未转染组；C组：PEF和PSV2neo共转染组。A组为实验组，B、C两组为对照组。按照说明书进行转染，加入400 μg PmlG419筛选，经3周后形成阳性克隆，扩增培养，应用基因转录方法检测miR-83a表达对体外BMSC的抗分化作用和生物学功能的影响；通过免疫组织化学法和实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）技术检测miR-83a在细胞中的表达，Real-time PCR测定转染后A549细胞中Ras、Raf、蛋白激酶B（Akt）和细胞外信号调节激酶（ERK） mRNA水平表达变化，并通过噻唑蓝（MTT）法、划痕实验、苏木素-伊红（HE）染色、显微镜等观察比较转染miR-83a的细胞的的迁移能力，诱导分化和形态学改变。结果Real-time PCR和免疫组织化学检查结果证实转染后细胞中miR-83a稳定表达；阿辛兰染色结果：培养第7天，诱导分化组细胞内充满了大量的棕色特异性染色颗粒，未诱导分化组未见特异性染色颗粒。Real-time PCR结果：A组细胞Ras、Raf、Akt mRNA相对表达量分别为0.97±0.27、0.54±0.18和0.99±0.31, B组细胞为1.79±0.36、1.70±0.33和2.06±0.42，C组细胞为1.68±0.30、1.58±0.25和1.89±0.31。和B、C组比较，A组细胞中Ras、Raf和Akt mRNA水平显著降低（t=1.531、1.838，P=0.016、0.011） 。MTT结果表明随着miR-83a与细胞效靶作用时间延长，抑制率明显增强，作用24、48、72 h后，细胞的凋亡率分别为（23.49±4.64）%、（45.73±8.72）%和（59.25±13.16）%，不同作用时间比较差异有统计学意义（χ^2=5.203、2.146，P=0.013、0.045）。划痕实验结果显示：miR-83a转染的细胞迁移能力低于正常细胞。miR-83a作用于细胞24 h后，形态学观察细胞发生凋亡或坏死。结论miR-83a转染对体外BMSC具有抑制分化和促进凋亡作用，它可能是通过抑制表皮生长因子受体（EGFR）和EGFRvⅢ信号传导通路中的RAS-RAF-丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷酸肌醇3激酶（PI3K）-Akt两条重要信号通路分子的活性来发挥作用。

摘要：目的探讨RNA干扰（RNAi）抑制胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1（IGF2BPl）基因对肾癌细胞活力和凋亡的影响及其机制。方法以人胚肾HEK293细胞为对照组细胞，通过Westernblot检测人肾癌786-0、A498、ACHN和CaKi-2细胞中IGF2BPl的蛋白表达。将设计并合成的IGF2BP1小干扰RNA（siRNA）经LipofectamineTM2000转染CaKi-2细胞，Westernblot检测转染后的细胞中IGF2BP1、Wnt／β-连环蛋白（B-catenin）信号通路关键分子p-catenin及增殖凋亡相关靶基因增殖细胞核抗原（PCNA）、生存素（Survivin）的蛋白表达。结果786-（0．415±0．038）、A498（0．278±0．030）、ACHN（0．326±0．032）和CaKi-2（0．557±0．053）细胞中IGF2BPl的表达均明显高于在HEK293细胞（0．062±0．009）表达（P=0．003），选择CaKi-2细胞为研究对象。IGF2BPlsiRNA转染后的细胞中IGF2BPI（0．073±0．010）、B-catenin（0．178±0．021）、PCNA（0．147±0．016）、Survivin（0．095±0．010）的蛋白表达均明显低于NC组（0．485±0．055）、（0．547±0．050）、（0．246±0．028）、（0．168±0．018），细胞活力（0．557,c0．045）明显低于NC组（0．804±0．057，细胞凋亡率（21．48±1．54）％明显高于NC组（2．46±0．27）％，差异均有统计学意义（P=0．000）。结论IGF2BPl在肾癌细胞表达升高，抑制其表达后可明显降低细胞活力和诱导凋亡，机制可能是Wnt／β-catenin信号通路的降低。

摘要：目的构建沉默DNMT1基因的重组体pshRNA-DNMT1,研究其体内外对胃癌AGS细胞增殖凋亡的影响。方法设计短发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸片断,克隆到载体pTZU6+1中,构建重组体pshRNA-DNMT1,转染胃癌细胞株AGS,用Western印迹检测DNMT1蛋白质水平变化,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法评估mRNA水平,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)动态监测活细胞数,电镜和原位末端标记技术(TUNEL)观察其体外的促凋亡作用。构建裸鼠胃癌模型,经pshRNA-DNMT1处理后观察瘤体大小,绘制生长曲线;用苏木素伊红(HE)染色法、电镜和TUNEL检测细胞凋亡,用增殖细胞核抗原(PCNA)法评价细胞的增殖能力。结果成功构建重组质粒pshRNA-DNMT1后,进行序列分析得到确证。pshRNA-DNMT1转染AGS细胞后24h出现DNMT1蛋白质表达量减少,抑制率为28·24%,48h为68·54%,72h为81·47%,重组质粒pshRNA-DNMT1对胃癌AGS细胞中DNMT1基因的转录有着明显抑制作用,转染后24h抑制率为21·63%,48h为52·97%,72h为72·06%。转染后24、48和72h细胞数存活率为PBS组的79·49%、51·63%和39·16%。pshRNA-DNMT1能抑制肿瘤生长,呈一定的时间和剂量依赖性。结论重组质粒pshRNA-DNMT1能特异有效地抑制胃癌细胞株AGS内DNMT1基因的表达。在胃癌细胞株AGS的体内外实验中均能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。