摘要：目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建两种一体化载体,用于敲除AML12细胞系中的微小RNA(microRNA,miR)-101a。方法:设计三条小鼠靶向miR-101a基因的小向导RNA(sgRNA)以及一条靶向绿色荧光蛋白基因的sgRNA,分别构建至一体化载体系统(pENTRY-U6-sgRNA-EF1α-WT Cas9),并将sgRNA1和sgRNA3构建至一体化载体系统(pENTRY-U6-sgRNA-U6-sgRNA-EF1α-Cas9 D10A)。在AML12细胞系中转染构建的一体化质粒,72 h后用T7核酸内切酶Ⅰ(T7EⅠ)检测剪切效率。将pENTRY一体化质粒通过Gateway的方式重组到pAD载体中,再转染293A细胞进行腺病毒包装。在AML12细胞系中进行腺病毒感染,72 h后检测miR-101a成熟体的表达水平以评估敲除效率。结果:构建的pENTRY一体化质粒经测序鉴定后正确。质粒转染AML12细胞系后进行T7EⅠ检测,均发生了明显剪切形成了两条带,表明设计的sgRNA有效果。pENTRY-体化质粒重组到pAD载体中,经酶切鉴定正确。腺病毒转染AML12细胞系后,实时荧光定量PCR检测表明细胞中miR-101a成熟体表达水平较对照组均明显下降(均P<0.01)。结论:构建了具有较高敲除效率的靶向小鼠miR-101a基因的一体化载体系统,为后续微小RNA功能研究奠定了技术支撑和实验基础,同时也为其他微小RNA敲除提供了借鉴方法。

摘要：背景:RNA干扰技术的应用,关键在于能够采用1个有效的基因转移系统将小干扰RNA转入至靶细胞,目前广泛应用的是构建小干扰RNA表达载体。目的:利用AdMax腺病毒载体系统构建表达人甲胎蛋白-小干扰RNA的腺病毒载体。设计、时间及地点:开放性实验,于2007-03/10在山东大学附属济南市中心医院中心实验室完成。材料:穿梭质粒pDC316-EGFP-U6为本元正阳基因技术公司产品;AdMax KitD试剂盒与低代数HEK293细胞为Microbix Biosystem sInc.(Canada)公司产品。方法:选择针对甲胎蛋白mRNA的特异性小干扰RNA靶序列,设计合成为相应的双链DNA,并将其与酶切线性化的pDC316-EGFP-U6载体片段连接,构建好的穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-AFP-siRNA和腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组产生重组腺病毒。主要观察指标:对重组腺病毒进行聚合酶链反应鉴定及扩增、纯化、滴度测定。结果:构建的穿梭质粒载体经聚合酶链反应鉴定和测序分析,证实与设计一致。重组腺病毒Ad-AFP-siRNA经聚合酶链反应和绿色荧光蛋白表达检测证实构建成功,测定滴度为1.4×109nfu/L。结论:实验成功构建了Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA重组腺病毒。

摘要：目的比较腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞(rMSCs)的荧光病毒基因表达的稳定性及持续时间。方法将含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,重组包装;将慢病毒和腺病毒载体分别感染rMSCs,培养5周,分别在1、3、5周通过流式细胞仪检测GFP的表达情况。从GenBank中调出人骨形态发生蛋白2(hBMP2)基因序列,设计带有NheI、AgeI双酶切位点引物。从人肝脏组织中抽提总RNA,再逆转录成cDNA,扩增出hBMP2基因的全长序列。测序验证后克隆到慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上,通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒载体。将该重组慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,通过重组而包装成能表达hBMP2基因的有活性的慢病毒。结果两种病毒载体感染后1周,绿色荧光蛋白表达分别是90%和71%,到5周时,慢病毒载体的绿色荧光蛋白表达明显高于腺病毒载体,分别是79%和0.05%。扩增出1.2kb左右的hBMP2全长基因与GeneBank中的hBMP2阅读框架序列完全一致;成功克隆和构建了含hBMP2基因的慢病毒载体pHIV-hBMP2;对慢病毒载体进行了成功包装和分析。结论含hBMP2基因的慢病毒载体可成功构建。慢病毒载体对大鼠骨髓间质干细胞的转染效率明显优于腺病毒载体。

摘要：目的探讨所设计针对血管紧张素Ⅱ1型受体（angiotensin Ⅱ receptor 1，AT1R）不同亚型的小发夹RNA（short hairpin ribonucleic acid，shRNA）的腺病毒注入小鼠脑干孤束核（nucleus tractus solitarius，NTS）相应受体mRNA表达抑制的有效性和特异性。方法选择雄性C57BL小鼠作为动物模型，将携带针对各自受体的shRNA腺病毒注入脑干右侧NTS部位，左侧注射对照用的腺病毒。正常饮食喂养10d后处死，采用原位杂交的方法检测每只小鼠脑干NTS的AT1aR mRNA和AT1bR mRNA表达情况。结果注入携带针对AT1aR的shRNA腺病毒后，AT1aR mRNA表达量的同位素亮度平均由1．81μCi／mg下降为0．71μCi／mg，降低了（61．2±6．8）％，P〈0．01；AT1bR mRNA的表达则不受影响（P〉0．05）。注入携带针对AT1bR的shRNA腺病毒，AT1bR mRNA表达量的同位素亮度平均由10.28μCi／mg下降到4．97μCi／mg，降低了（51．6±5．2）％，P〈0．01；而AT1aR mRNA的表达不受影响（P〉0．05）。结论所设计的shRNA，可以特异地抑制相应各自亚型受体mRNA的表达，而对另一个亚型受体mRNA表达未发生交叉影响。

摘要：背景:RNA干扰已被多次证实是一种特异、高效、经济的使基因表达受抑的技术手段。目的:以短发卡RNA腺病毒表达载体为介导,构建介导shRNA-c-myc复制缺陷型重组腺病毒。设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-09/2007-09在环境与疾病相关基因教育部重点实验室完成。材料:人骨肉瘤细胞系OS-9901由解放军第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所范清宇教授惠赠。方法:设计有短发夹RNA结构的3对单链寡核苷酸(ssoligo),经变性退火为双链寡核苷酸(dsoligo)插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序正确后经阳离子脂质体介导入人骨肉瘤细胞系OS-9901,通过反转录-聚合酶链反应方法筛选对c-myc沉默效果最佳穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,然后与腺病毒骨架质粒行同源重组,筛选出正确重组子,用293A细胞包装出表达c-myc-shRNA的复制缺陷型重组腺病毒。主要观察指标:①观察细胞病变效应。②通过50%组织培养感染剂量测定病毒滴度。结果:电泳验证后的dsoligo插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序结果提示所构建的pENTR/U6-shRNA质粒正确。对c-myc沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,经PacⅠ酶切线性化后同源重组后成功构建了介导c-myc-shRNA复制缺陷型重组腺病毒。3d开始出现细胞病变效应,6d更加明显,测定证实病毒滴度为10-3.8/0.1mL。结论:成功构建介导shRNA-c-myc复制缺陷型重组腺病毒。

摘要：背景:骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)是外源性目的基因的良好靶细胞,在脊髓损伤的修复中具有良好的应用前景。目的:观察重组腺病毒介导的胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)基因在体外培养的骨髓基质干细胞中的表达,并探讨其生物学活性。设计:以细胞为研究对象,对照观察性研究。单位:一所大学医院骨科实验室。材料:实验于2004-03/06在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成。SD大鼠24只,雌雄不限,体质量(180±20)g。干预:用重组腺病毒载体Adv-GDNF感染体外培养的BMSCs,并与脊髓背根神经节共培养。免疫荧光化学的方法检测BMSCs中的GDNF的表达,提取细胞总RNA进行RT-PCR扩增GDNF基因,应用ELISA方法检测其培养上清中的GDNF含量,并通过与脊髓背根神经节共培养观测GDNF的活性。主要观察指标:主要结局:①RT-PCR。②免疫荧光结果。③GDNF的体外活性。次要结局:①BMSCs的培养与鉴定。②ELISA检测蛋白表达与时间的关系。结果:免疫荧光显示Adv-GDNF感染BMSCs48h后即有GDNF的表达,体外培养的BMSCs经Adv-GDNF转染后有GDNF的转录,其培养上清应用ELISA方法分析,在感染24h后即有GDNF的表达,并可持续5～7d的高峰。Adv-GDNF感染的BMSCs的培养液上清可以?

摘要：目的:探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子165基因转染大鼠皮瓣,对皮瓣早期断蒂的影响。方法:实验于2004-08/2005-09在安徽医科大学第一附属医院外科动物实验中心及中心实验室完成。健康SD雄性大鼠30只,随机分成3组:目的组、绿色荧光蛋白对照组、空白对照组,每组10只。所有实验大鼠背部设计2cm×6cm随意皮瓣,蒂位于髂脊水平。皮瓣形成后,术时即刻将磷酸盐缓冲液稀释的重组复制缺陷型腺病毒携带血管内皮细胞生长因子165基因溶液(目的组)、磷酸盐缓冲液稀释的重组复制缺陷型腺病毒携带绿色荧光蛋白溶液(荧光蛋白对照组)、磷酸盐缓冲液溶液(空白对照组)1mL注射到大鼠皮瓣内,给药后即刻以3-0丝线原位缝合,继续单笼饲养。所有实验大鼠皮瓣4d后断蒂,断蒂后7d观测皮瓣存活面积,取皮瓣远端存活区组织苏木精-伊红染色,光镜下观察组织学变化,免疫组织化学染色检测血管内皮细胞生长因子165表达情况,用CD34免疫组织化学染色计算血管密度。结果:①断蒂后7d,所有实验动物全部存活,皮瓣存活区与坏死区已经明确。②皮瓣存活率、皮瓣血管断面密度目的组和对照组之间差异有显著性犤皮瓣存活率:目的组为(98.8±1.5)%,荧光蛋白对照组为(78.3±2.5)%,空白对照组为(79.2%±2.4)%;皮瓣血管断面密度:目的组为(49.6±6.3)个/高倍视野,荧光蛋白对照组为(37.5±3.0)个/高倍视野,空白对照组为(39.5±3.0)个/高倍视野,P0.05)。③免疫组织化学染色各组均可见棕黄色颗粒沉积,目的组比对照组染色深。④组织学观察,目的组皮瓣真皮、肉芽及肌肉中可见大量毛细血管,而对照组较少。结论:应用重组复制缺陷型腺病毒携带血管内皮细胞生长因子165基因转染大鼠皮瓣具有促进皮瓣早期断蒂的作用。

摘要：背景:烧创伤后创面愈合多伴有瘢痕增生,内皮细胞在瘢痕增生中具有重要作用,抑制内皮细胞的生长可以在一定程度上减轻瘢痕增生。目的:构建含有人内皮抑素基因的重组腺病毒Ad/hEnd,并观察与感染该病毒的角朊细胞共培养时内皮细胞增殖特性的改变。设计、时间及地点:观察对照实验,于2006-09/2007-05在解放军第三军医大学西南医院烧伤研究所国家重点实验室完成。材料:pAdTrack-CMV及pAdEasy-1购自美国Stratagene公司;293细胞及大肠杆菌***5α由本室保存。方法:以人胎肝组织mRNA为模板,通过反转录-聚合酶链反应及聚合酶链反应获得内皮抑素基因序列,插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,获得重组质粒pAdTrack-ES。经鉴定后将阳性重组子转化至pAdeasy1受体菌,筛选阳性克隆。脂质体介导转染293细胞,获取Ad/hEnd,经聚合酶链反应鉴定及上清中内皮抑素含量检测后,感染角朊细胞,采用套皿法与内皮细胞共培养。并与未转染的角朊细胞进行对照观察。主要观察指标:pAd/hEnd的同源重组及其鉴定,Ad/hEnd的产生与鉴定,转染293细胞后内皮抑素的表达,Ad/hEnd的纯化与滴度测定,培养液中内皮抑素含量,内皮细胞凋亡百分数及内皮细胞抑制率测定。结果:①成功获取了Ad/hEnd,病毒滴度可达1.65×1012PFU/L。②感染Ad/hEnd的角朊细胞可有效表达并分泌内皮抑素,连续培养3d后,培养液中内皮抑素含量可达226μg/L。③与转基因角朊细胞共培养的内皮细胞凋亡百分数与细胞抑制率均显著高于对照组(P<0.05)。结论:与内皮细胞共培养时,转Ad/hEnd角朊细胞可通过分泌内皮抑素促进内皮细胞凋亡,并抑制其增殖。

摘要：目的将腺病毒Ad5/F11p造血细胞靶向和甲病毒复制子载体目的基因高效转录的特点相结合,构建腺病毒-甲病毒杂合载体,以提高目的基因在造血细胞的表达水平。方法基本实验过程包括骨架质粒构建,穿梭质粒构建,同源重组产生杂合病毒基因组,杂合病毒在包装细胞的拯救和扩增,以及杂合病毒对造血细胞基因转移效率的初步评价。具体步骤如下:利用重叠延伸PCR技术将pFiber5/11p质粒上Ad5的E4区部分删除产生骨架质粒pAdEasy/F11pDE4orf3。在pShuttle质粒的多克隆位点处分别插入造血细胞特异性启动子(CD11a promoter,CD11Ap)、甲病毒载体元件(nsP)、目的基因(GFP)、PolyA加尾信号构建杂合穿梭质粒pSh-SFV-GFP。骨架质粒与穿梭质粒在大肠杆菌BJ5183菌株中同源重组产生杂合病毒质粒pAd5/F11p-SFV-GFP,经与辅助病毒质粒Ad5/f11p-HV共转染293细胞后拯救出杂合病毒Ad5/F11p-SFV-GFP,经CsCl密度梯度离心法纯化,得到的病毒滴度为3×1010pfu/ml。与对照病毒Ad5-GFP相同感染复数(100MOI)分别感染U937细胞,利用流式细胞术检测GFP+细胞比例。结果pAdEasy-1/F11p-E4orf3和pSh-SFV-GFP经相应酶切和测序鉴定,与预期设计一致;CsCl密度梯度离心纯化得到杂合病毒;100MOI Ad5/F11p-SFV-GFP感染U937细胞2 d后,GFP+细胞比例为55.79%,而对照病毒Ad5-GFP的感染效率为2.42%。结论成功构建了腺病毒-甲病毒杂合载体,为进一步评价其对造血细胞的基因转移效率奠定了基础。

摘要：目的构建NF-κB p65亚基特异的RNA干扰(RNAi)腺病毒表达载体,并验证其对p65亚基的基因沉默效应。方法设计合成三对针对p65 mRNA不同位点的短发夹RNA(shRNA)编码序列,克隆到穿梭载体中,通过体外同源重组将短干扰RNA(siRNA)表达盒转移到腺病毒骨架质粒,构建RNAi腺病毒表达载体;在HEK293A细胞中包装并扩增病毒、空斑实验法进行病毒滴度测定;腺病毒感染人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞,Western印迹法和免疫细胞化学法验证构建的RNAi腺病毒对p65蛋白表达的抑制效应。结果成功构建了NF-κB p65亚基特异的RNAi腺病毒表达载体,获得高滴度的腺病毒液;RNAi腺病毒感染ECV304细胞后可以高效抑制p65蛋白的表达,且对p65蛋白表达的抑制作用可持续6 d以上。结论应用RNAi腺病毒表达载体能有效阻断目的基因的表达。